2019年10月m6A RNA甲基化研究總結(jié)

發(fā)稿時間：2019-11-13來源：天昊生物

2019年10月份m6A RNA甲基化方向共有15篇5分以上文章發(fā)表（Epub時間最早也在10月份），其中10分以上有10篇文章。值得一提的是多篇文章由中國科研團隊完成！這15篇文章中2篇與病毒相關(guān)，2篇與植物相關(guān)，1篇與組織m6A甲基化圖譜有關(guān)，1篇與紅細胞生成相關(guān)，4篇news或letter形式文章，還有5篇與腫瘤相關(guān)（其中2篇胃癌m6A相關(guān)的文章應(yīng)該是胃癌中僅有的2篇10分以上paper，分別由南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院和上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟醫(yī)院的團隊完成！）。

 

一、短文形式的文章

10月28日Nature Methods以news & views的形式再次介紹了2種RNA修飾的表征方法——DART-seq和m1A-IP-seq/m1A quant-seq（均在2019年Nature Methods上發(fā)表），研究人員改造了酶，并利用酶介導(dǎo)的突變特征在單堿基分辨率上map m6A和m1A，這樣能夠改善傳統(tǒng)方法的局限性，如低的分辨率、高的樣本起始量需求、高花費、繁瑣的實驗步驟、交叉反應(yīng)和靈敏度等問題。

 

10月12日Cell Research以Letter形式介紹了m6A修飾能夠促進共轉(zhuǎn)錄的R環(huán)形式以阻止Pol II通讀活性，從而實現(xiàn)轉(zhuǎn)錄終止。敲降METTL3能夠顯著減少m6A+基因在轉(zhuǎn)錄終止位點（TESs）的R-loop積累，進而擾亂終止。TESs的R-loop恢復(fù)及通讀活性的抑制需要METTL3的甲基轉(zhuǎn)移酶活性。METTL3對R-loop及Pol II的調(diào)控影響表明額外的接頭蛋白的存在，來實現(xiàn)橋接METTL3和Pol II的相互作用。因此需要進一步的研究揭示調(diào)控這種相互作用的蛋白，進而闡明潛在的機制。（中科院和清華團隊）

 

10月22日復(fù)旦大學(xué)和同濟大學(xué)團隊參與的一項研究也發(fā)現(xiàn)在in vitro和in vivo的實驗均證實m6A能夠增強YTHDF2的相分離。盡管重組的YTHDF2本身in vitro條件下也可以發(fā)生相分離，但是m6A修飾顯著增強了這種能力，而且in vivo實驗中YTHDF2液狀相分離可能是基于其結(jié)合到m6A修飾的mRNA分子上。而先前已有多個課題組（清華團隊，康奈爾團隊等）報道了YTHDF家族蛋白顯示出相分離潛能受m6A修飾的mRNA影響。（詳見鏈接：m6A領(lǐng)域熱點與熱點相結(jié)合）

 

這篇文章主要總結(jié)了m6A修飾在自身免疫病中的潛在作用，m6A的調(diào)控酶可能作為自身免疫病新的潛在治療靶點，這些相關(guān)的研究均在2018-2019年完成，為自身免疫病的研究提供了新的思路。

 

二、m6A圖譜

北大生科院伊成器教授課題組和復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院樊嘉院士課題組合作揭示了人和小鼠組織中m⁶A和m⁶Am甲基化圖譜及調(diào)控作用。m6A（mRNA中最豐富的內(nèi)部修飾）和m⁶Am（第一個轉(zhuǎn)錄核苷酸上的修飾）是兩種可逆的表觀轉(zhuǎn)錄組標(biāo)記。然而，人和小鼠組織中的m⁶A和m⁶Am的特征及分布方式卻鮮為人知。這篇文章報道了43種人組織和16中小鼠組織中的m⁶A和m⁶Am甲基化圖譜，證實了腦組織具有最強的組織特異性。一小部分的組織特異性的m⁶A peaks可以很容易區(qū)分組織類型。m⁶A和m⁶Am的整體水平部分與其寫蛋白或擦除蛋白的表達水平相關(guān)。另外，含有m⁶A的區(qū)域SNPs很豐富。物種間進一步的分析顯示是物種而不是組織類型主要決定了甲基化?？傮w上，這項研究對于解析哺乳動物組織中m⁶A和m⁶Am的圖譜及調(diào)控提供了深度的資源。

 

三、病毒

該研究發(fā)現(xiàn)人的呼吸道合胞體病毒（RSV）RNAs在關(guān)鍵區(qū)域被m6A修飾，而且這些修飾能夠增強病毒的復(fù)制和致病。敲降m6A甲基轉(zhuǎn)移酶降低了RSV復(fù)制和基因表達，而敲低m6A脫甲基酶則會有相反的影響。G基因轉(zhuǎn)錄本有最豐富的m6A修飾。重組的RSV變異體表達的G轉(zhuǎn)錄本缺乏特定的m6A簇，在A549細胞、原代分化良好的人呼吸道上皮細胞培養(yǎng)中及棉鼠呼吸道中顯示出復(fù)制的減少。m6A缺陷的變異體之一在棉鼠中是高度減毒的，但是保留了高度的免疫原性?？傮w上，這些結(jié)果證明了病毒m6A甲基化增強了RSV的復(fù)制和致病，并且發(fā)現(xiàn)病毒m6A甲基化可以作為靶點，去合理設(shè)計候選的RSV或可能其他的肺炎病毒的減毒活疫苗。

 

這篇文章在卡波西肉瘤相關(guān)的孢疹病毒（KSHV）RNA分子ORF50中發(fā)現(xiàn)了來源于“皇室家族”（Royal family）7個成員可能作為m6A的讀蛋白，包括SND1。利用RIP-seq和eCLIP（enhanced CLIP）分析表征SND1蛋白結(jié)合的轉(zhuǎn)錄組特征，顯示SND1確實作為一個m6A reader蛋白。進一步證明了ORF50 RNA的m6A修飾對SND1結(jié)合至關(guān)重要，其反過來穩(wěn)定了ORF50轉(zhuǎn)錄本。更重要的是，SND1敲除會抑制KSHV早期基因表達，說明SND1對KSHV的溶菌復(fù)制是必需的。因此這項工作證實了“皇室家族”的成員有m6A-reading能力，除了蛋白甲基化修飾，極大地增加了其表觀上的功能。

 

四、植物

線粒體是ATP產(chǎn)生的主要場所，在很多對于細胞起決定作用的代謝過程中發(fā)揮重要作用。作為一種古老的細菌內(nèi)共生體的殘余物，線粒體含有自己的遺傳物質(zhì)（線粒體DNA，mtDNA）和一套蛋白合成的機器。植物中mtDNA的表達是復(fù)雜的，特別是在轉(zhuǎn)錄后水平上。在轉(zhuǎn)錄后，被細胞器核糖體翻譯前，多順反子pre-RNAs會經(jīng)歷廣泛地修飾，包括裁剪、剪接和編輯。這項研究集中在植物線粒體的腺嘌呤核苷酸的m6A修飾，m6A是核編碼mRNAs中主要的一種修飾方式。這種動態(tài)修飾的生物學(xué)重要性正在研究中，但是廣泛接受的是m6A調(diào)控結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變進而影響RNA的穩(wěn)定性和/或活性。對擬南芥和花椰菜線粒體進行m6A-RIP-seq實驗，發(fā)現(xiàn)其中m6A修飾圖譜的信息。結(jié)果顯示m6A靶向多種不同的線粒體轉(zhuǎn)錄本類型，包括已知基因、mtORF及非編碼RNA。非編碼RNA會經(jīng)歷多樣的m6A修飾，而mRNA中的m6A修飾似乎傾向于起始編碼的位置，并且調(diào)控其穩(wěn)定性。

 

N⁶-甲基腺嘌呤是真核生物mRNA中最豐富的修飾方式。盡管m6A已經(jīng)被證實影響幾乎所有方面的RNA代謝，但在植物中其對轉(zhuǎn)錄后翻譯效率平衡的整體作用仍然未知。這項研究中科研人員對兩株玉米自交系進行轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)m6A分布和多聚核糖體分析實驗，以評估m(xù)6A修飾和翻譯狀態(tài)的整體相關(guān)性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)m6A位點廣泛分布在多種蛋白編碼基因中，只限于共有的基序（motif），主要富集在3’非翻譯區(qū)，并且與可變的多聚腺苷酸化利用高度協(xié)調(diào)，這些說明m6A修飾在調(diào)控可變腺苷酸化位點的選擇中具有重要作用。更為重要的是，發(fā)現(xiàn)m6A修飾顯示出與翻譯狀態(tài)與多層面的相關(guān)性，主要基于其強度和遺傳位點。而且，實驗中觀察到m6A修飾存在大量的種內(nèi)的變異性，這種自然的變異部分由基因特異性表達和可變剪接所驅(qū)動。總體上，這些結(jié)果為確定玉米中受m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本提供了寶貴的資源，而且為更好地理解自然的m6A變異在介導(dǎo)基因表達調(diào)控鋪平了道路。

 

五、腫瘤

鼓樓醫(yī)院團隊主要研究METTL3在胃癌中的生物學(xué)功能和臨床意義。主要研究成果如下：m6A RNA總體水平在胃癌中是顯著增加的，而METTL3是m6A修飾主要的調(diào)控因素。METTL3的表達在胃癌組織中顯著上升，并且與較差的預(yù)后相關(guān)。多元Cox回歸分析顯示METTL3表達水平可以作為獨立的預(yù)后因素，能夠有效地預(yù)測胃癌患者的生存。而且，體外和體內(nèi)實驗中METTL3的過表達均能夠促進胃癌增殖和肝轉(zhuǎn)移。機制上，P300介導(dǎo)的METTL3啟動子區(qū)域H3K27乙?；せ钅軌蛘T導(dǎo)METTL3轉(zhuǎn)錄，進而激發(fā)了HDGF mRNA的m6A修飾，并且m6A的reader IGF2BP3能夠直接識別并結(jié)合到HDGF mRNA的m6A位點上，最終增強其mRNA穩(wěn)定性。分泌的HDGF促進腫瘤血管生成，而核內(nèi)的HDGF激活了GLUT4和ENO2的表達，進而增加了胃癌細胞的糖酵解，這些與隨后的腫瘤生長和肝轉(zhuǎn)移相關(guān)?？偨Y(jié)以上結(jié)果，這項研究證實了上升的METTL3表達促進了胃癌腫瘤的血管生成和糖酵解過程，表明METTL3的表達是胃癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點。

 

仁濟醫(yī)院的團隊同樣也是研究METTL3在胃癌中的重要作用。主要的研究方法和結(jié)果如下：利用qRT-PCR和免疫組化實驗發(fā)現(xiàn)METTL3這一m6A甲基轉(zhuǎn)移酶在胃癌中呈現(xiàn)上調(diào)；臨床上，上升的METTL3水平顯示有較差的預(yù)后。體外的實驗表明METTL3對于腫瘤上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化這一過程是需要的；體內(nèi)實驗說明METTL3對于胃癌轉(zhuǎn)移是需要的。通過轉(zhuǎn)錄組測序、m6A甲基化測序、MeRIP qRT-PCR、共焦免疫熒光實驗、熒光素酶報告基因?qū)嶒?、共免疫沉淀、RNA免疫沉淀和染色質(zhì)免疫沉淀實驗等從機制上發(fā)現(xiàn)了胃癌細胞中METTL3介導(dǎo)的m6A修飾，并且發(fā)現(xiàn)了ZMYM1作為METTL3的一個真實的靶點。ZMYM1的m6A修飾增加其mRNA穩(wěn)定性，主要基于讀蛋白HuR依賴的通路。另外ZMYM1結(jié)合并調(diào)控了E-鈣黏蛋白（E-cadherin）啟動子區(qū)域的抑制，通過招募CtBP/LSD1/CoREST的方式，因而促進上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化程序和轉(zhuǎn)移。總結(jié)以上結(jié)果，這項研究發(fā)現(xiàn)m6A修飾在胃癌中的關(guān)鍵作用，同時揭示了METTL3/ ZMYM1/E-cadherin信號通路作為胃癌抗轉(zhuǎn)移策略的潛在治療靶點。

 

中科院昆明動物所的科研團隊近期的成果顯示m6A的結(jié)合蛋白之一YTHDF1與低氧適應(yīng)和非小細胞肺癌（NSCLC）進展有關(guān)。低氧自然發(fā)生在高海拔地區(qū)，病理上主要發(fā)生在低氧性實體瘤中。這項研究報道了參與多種人類癌癥的基因在藏族人和6種西藏馴養(yǎng)動物中比相應(yīng)低地的進化更快。此外，m6A修飾的mRNA結(jié)合蛋白YTHDF1，一個進化上積極選擇的高原適應(yīng)基因在包括NSCLC在內(nèi)的多種腫瘤中被擴增。結(jié)果顯示YTHDF1的缺陷能夠抑制NSCLC細胞增殖和異種移植腫瘤的形成，通過調(diào)控CDK2, CDK4和cyclin D1的翻譯效率；而且YTHDF1的缺失從頭（de novo）抑制了肺腺癌的進展。然而，實驗觀察到Y(jié)THDF1的高表達與更好的臨床效果相關(guān)，因其缺失會導(dǎo)致癌細胞對鉑化合物化療產(chǎn)生耐藥。機制研究發(fā)現(xiàn)Keap1-Nrf2-AKR1C1信號軸是YTHDF1的下游調(diào)控因素。總結(jié)來看，這些發(fā)現(xiàn)為揭示YTHDF1在低氧適應(yīng)和非小細胞肺癌進展的關(guān)鍵作用提供了依據(jù)。

 

中山大學(xué)腫瘤防治中心謝丹、徐瑞華等課題組發(fā)現(xiàn)環(huán)狀circNSUN2的m6A修飾促進其出核轉(zhuǎn)運，穩(wěn)定期下游HMGA2從而促進結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移。這篇文章首先發(fā)現(xiàn)circNSUN2在結(jié)直腸癌伴有肝轉(zhuǎn)移患者的腫瘤組織和血清樣本中呈現(xiàn)表達上調(diào)，并且預(yù)示了較差的預(yù)后。In vivo實驗證實了circNSUN2在PDX轉(zhuǎn)移瘤模型中促進了肝轉(zhuǎn)移的發(fā)生，并且體外實驗也驗證了其促進癌細胞侵襲。更重要的是circNSUN2的m6A修飾促進其出核轉(zhuǎn)運，通過在細胞質(zhì)中形成circNSUN2/IGF2BP2/HMGA2這樣一個三元RNA-蛋白復(fù)合物，circNSUN2能夠增強HMGA2的穩(wěn)定性從而促進結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移進展。臨床上，circNSUN2和HMGA2表達水平的上調(diào)在肝轉(zhuǎn)移組織樣本中比原發(fā)的結(jié)直腸癌組織更加顯著。這些發(fā)現(xiàn)表明circNSUN2可以作為結(jié)直腸癌的預(yù)后標(biāo)志物，同時可能成為未來的潛在治療靶點。（非編碼RNA m6A修飾詳見鏈接：2019國自然最全m6A RNA甲基化解析）

 

中山大學(xué)團隊的這項工作也是揭示的結(jié)直腸癌中長鏈非編碼RNA和m6A修飾之間的功能機制。YAP激活對于包括結(jié)直腸癌在內(nèi)的腫瘤發(fā)展至關(guān)重要，然而在癌癥進展中m6A修飾的lncRNA是否可以調(diào)控YAP的激活仍然未知。因此，研究人員利用RIP-seq、RNA FISH、免疫熒光染色及生化實驗方法發(fā)現(xiàn)lncRNA GAS5能夠直接與YAP的WW結(jié)構(gòu)域相互影響，進而促進內(nèi)源的YAP核質(zhì)轉(zhuǎn)運，并且促進其磷酸化及隨后的泛素化介導(dǎo)的降解，最終在體外和體內(nèi)抑制結(jié)直腸癌進展。同時證實了YTHDF3不僅是YAP的新的靶點，而且在YAP信號通路中具有重要作用，主要通過促進m6A修飾的GAS5降解，這對了解結(jié)直腸癌的進展可能是一個新的思路。臨床上，結(jié)直腸癌患者腫瘤中l(wèi)ncRNA GAS5的表達與YAP和YTHDF3蛋白的水平呈負相關(guān)。（非編碼RNA m6A修飾詳見鏈接：2019國自然最全m6A RNA甲基化解析）

 

六、紅細胞生成

控制紅細胞特化、成熟和相關(guān)疾病的很多調(diào)控特征仍然是個謎。為了發(fā)現(xiàn)紅細胞生成新的調(diào)控因素，研究人員利用功能基因組篩選那些影響紅細胞marker CD235a/GYPA表達的基因。在這些靶點的驗證中包括編碼m6A甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的基因，包括METTL14, METTL3和WTAP。結(jié)果證實了m6A甲基轉(zhuǎn)移酶活性能夠促進紅細胞基因表達程序，是通過選擇性翻譯約300個m6A修飾基因的方式，包括那些編碼SETD組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶、核糖體元件及polyA RNA結(jié)合蛋白的基因。顯著的是，m6A標(biāo)記的消失會導(dǎo)致關(guān)鍵的紅細胞特定KLF1轉(zhuǎn)錄靶點上H3K4me3標(biāo)記的消失。更進一步地，每個m6A甲基轉(zhuǎn)移酶亞基和其部分mRNA靶點對于初級的骨髓來源的祖細胞中紅細胞特化必需的。因此，m6A mRNA標(biāo)記促進了人紅細胞生成中需要的一些基因的翻譯。

 

天昊生物

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