天昊目的區(qū)域甲基化測序在不同研究領(lǐng)域客戶文章集錦

發(fā)稿時(shí)間：2020-09-30來源：天昊生物

截止到2020年9月，
天昊MethylTarget^?技術(shù)已經(jīng)完成252個(gè)項(xiàng)目

  對于DNA目的區(qū)域甲基化水平的檢測，目前市場上有各種技術(shù)平臺，但是不同技術(shù)均有各自的技術(shù)痛點(diǎn)，要么成本高（目的區(qū)域液相芯片捕獲），要么不能準(zhǔn)確定量研究（MSP/BSP），要么操作復(fù)雜、不具有單堿基分辨率（色譜、質(zhì)譜），無法獲得甲基化單倍型（焦磷酸測序）。而天昊生物的多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術(shù)MethylTarget^?針對這些核心痛點(diǎn)，不但從技術(shù)策略及生信分析方面創(chuàng)新性地解決了上述技術(shù)難題，還有更多應(yīng)用優(yōu)勢：

※ 性價(jià)比高：傳統(tǒng)克隆測序一個(gè)片段10個(gè)克隆的價(jià)格，MethylTarget^?可以完成約60個(gè)片段的檢測（檢測深度為1000X，相當(dāng)于1000個(gè)克隆）；

※ 精確度高：基于二代測序數(shù)據(jù)檢測甲基化程度，精確到單堿基分辨率，與全基因組甲基化測序，RRBS數(shù)據(jù)，甲基化芯片數(shù)據(jù)有高度一致性；

※ 準(zhǔn)確定量：測序深度高達(dá)1000X，并可以進(jìn)一步加深，相比于傳統(tǒng)克隆測序，可以對位點(diǎn)甲基化程度進(jìn)行準(zhǔn)確定量；

※ 技術(shù)靈活：基于多重PCR對目標(biāo)區(qū)域進(jìn)行富集，可隨時(shí)應(yīng)對基因和位點(diǎn)的變化和改動(dòng)，并且可以獲得每個(gè)片段的甲基化單倍型。

MethylTarget^?技術(shù)自服務(wù)市場以來，其準(zhǔn)確性和性價(jià)比優(yōu)勢快速獲得了大量課題組的認(rèn)可。

優(yōu)秀的技術(shù)平臺結(jié)合課題組的專業(yè)研究思路，已經(jīng)快速轉(zhuǎn)化為一大波優(yōu)質(zhì)SCI文章，下面按不同研究領(lǐng)域分別向大家介紹：

蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院遺傳流行病與基因組學(xué)研究中心雷署豐教授團(tuán)隊(duì)文章《外周血單個(gè)核細(xì)胞中類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎相關(guān)的DNA甲基化位點(diǎn)》發(fā)表在Annals of the Rheumatic Diseases (IF：16.102)。

作者首先利用甲基化450K芯片和LncRNA&mRNA Human Gene Expression MicroarrayV.4.0芯片對43例樣本中外周血單個(gè)核細(xì)胞的基因組甲基化水平和RNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測 (RA：healthy = 25：18)，然后基于甲基化數(shù)據(jù)和表達(dá)量數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析和甲基化的因果推理測試，構(gòu)建差異甲基化基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用天昊生物MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術(shù)在驗(yàn)證階段的樣本中檢測10個(gè)DMP的甲基化水平，繼而對經(jīng)驗(yàn)證的PARP9基因在Jurkat 細(xì)胞中進(jìn)行相關(guān)的細(xì)胞學(xué)功能實(shí)驗(yàn)。

上海復(fù)旦大學(xué)生科院王久存教授課題組文章《全基因組DNA甲基化研究發(fā)現(xiàn)系統(tǒng)性硬化癥患者CD4⁺和CD8⁺ T細(xì)胞的干擾素相關(guān)基因表現(xiàn)低甲基化狀態(tài)》發(fā)表在The Journal of Investigative Dermatology (IF：7.143)。

首先利用全基因組甲基化芯片檢測確定差異甲基化位點(diǎn)，GO富集分析發(fā)現(xiàn)干擾素相關(guān)通路基因在2種T細(xì)胞的DMR中都顯著富集。利用天昊生物MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術(shù)檢測第一階段的部分樣本，表明450K甲基化檢測芯片和目的區(qū)域甲基化技術(shù)結(jié)果的一致性非常好，Pearson相關(guān)性高達(dá)86%和90%。目的區(qū)域甲基化技術(shù)在獨(dú)立的樣本中驗(yàn)證第一階段獲得的干擾素信號通路基因（16個(gè)基因；62個(gè)位點(diǎn)），其中5個(gè)基因的差異甲基化得到驗(yàn)證。通過檢測干擾素信號通路基因的表達(dá)量，部分基因的表達(dá)量與甲基化程度表現(xiàn)顯著的負(fù)相關(guān)。通過檢測血液 IFN-a、IFN-b水平，發(fā)現(xiàn)部分干擾素信號通路基因高表達(dá)與高IFN-a、IFN-b水平相關(guān)。

蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)院王明華教授和上海復(fù)旦大學(xué)生科院王久存教授在食管鱗狀細(xì)胞癌DNA甲基化方向文章兩連發(fā)，Clinical Epigenetics (IF：5.028)；Frontiers in Genetics (IF：3.258)。

TCGA數(shù)據(jù)庫來源的84例ESCC腫瘤組織和16例癌旁組織甲基化檢測數(shù)據(jù)作為發(fā)現(xiàn)階段，來源于GEO的4例ESCC腫瘤組織和8例對照的甲基化芯片檢測數(shù)據(jù)作為驗(yàn)證階段，確定了5個(gè)潛在DNA甲基化biomarker，這5個(gè)區(qū)域在ESCC腫瘤組織中表現(xiàn)為高甲基化，且在正常人的外周血單核白細(xì)胞和外周血白細(xì)胞中表現(xiàn)低甲基化。依據(jù)這5個(gè)區(qū)域甲基化程度建立的預(yù)測模型，對腫瘤和癌旁具有良好的區(qū)分特性（sensitivity = 0.89, specificity = 0.81, AUC = 0.87）。在本實(shí)驗(yàn)收集的94對癌和癌旁組織中，采用MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術(shù)驗(yàn)證甲基化程度，進(jìn)一步驗(yàn)證了該模型的效力（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖如下左圖）。

作者同樣基于文獻(xiàn)檢索和數(shù)據(jù)庫信息篩選了65個(gè)候選的腫瘤抑癌基因作為潛在DNA甲基化biomarker，然后利用MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術(shù)在94對ESCC癌和癌旁組織中對經(jīng)篩選的6個(gè)基因進(jìn)行甲基化水平驗(yàn)證，ADHFE1、EOMES、SALL1和TFPI2被驗(yàn)證，而且在ESCC樣本中表現(xiàn)為顯著的高甲基化?；谶壿嫽貧w的預(yù)測模型具有中等的ESCC分類性能（sensitivity = 0.66, specificity = 0.87, AUC = 0.81）。因此這一數(shù)據(jù)表明ADHFE1、EOMES、SALL1和TFPI2的甲基化panel可能是一種有效的基于甲基化的ESCC診斷方法（實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖如下右圖）。

浙江大學(xué)朱益民教授課題組和來茂德教授課題組文章發(fā)表在Epigenomics (IF：4.112)上，利用基因甲基化水平建立了一種區(qū)分正常和腫瘤組織的新型結(jié)直腸癌鑒別模型。

作者首先從文獻(xiàn)中檢索CRC相關(guān)的甲基化調(diào)控基因，基于TCGA數(shù)據(jù)庫中373例樣本的甲基化數(shù)據(jù)和RNA表達(dá)數(shù)據(jù)，驗(yàn)證候選基因啟動(dòng)子區(qū)域和第一外顯子中CpG位點(diǎn)的甲基化水平，并基于LASSO算法進(jìn)一步篩選候選基因和CpG位點(diǎn)。隨后在94例中國CRC樣本中進(jìn)行候選基因和CpG位點(diǎn)驗(yàn)證（天昊目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法），基于LASSO算法建立基于甲基化水平的CRC鑒別模型，并在TCGA數(shù)據(jù)和CRC患者數(shù)據(jù)中對診斷模型進(jìn)行評估。

中南大學(xué)湘雅三醫(yī)院胃腸外科李小榮教授課題組在Frontiers in Oncology (IF：4.848)雜志上報(bào)道了多個(gè)基因的啟動(dòng)子甲基化和結(jié)直腸癌臨床病理特征的相關(guān)性。

作者試圖在結(jié)直腸癌(CRC)數(shù)據(jù)庫和他們的CRC隊(duì)列的基礎(chǔ)上找到理想的表觀遺傳基因參與CRC。在最新的數(shù)據(jù)庫中，CRC中極高頻率高甲基化的前20個(gè)基因被鑒定出來。然后利用天昊目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法在成對的結(jié)直腸腫瘤樣本、癌旁樣本和四種CRC細(xì)胞系中驗(yàn)證HOXA5, HOXA2和HOXA6基因甲基化水平。結(jié)果表明，CRC組織和細(xì)胞在3個(gè)HOXA基因啟動(dòng)子區(qū)域具有更高的甲基化水平。HOXA基因的ROC曲線在區(qū)分健康個(gè)體和CRC患者組織方面表現(xiàn)出良好的診斷能力，特別是對于I期患者。對HOXA基因的甲基化模式與臨床指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)HOXA2甲基化與年齡、淋巴轉(zhuǎn)移（N）、分期、遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移（M）、淋巴血管侵犯、周圍神經(jīng)侵犯、淋巴結(jié)數(shù)目顯著相關(guān)。HOXA5甲基化與年齡、T、M、分期和腫瘤狀態(tài)相關(guān)，HOXA6甲基化與年齡和KRAS突變相關(guān)。

廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科尹瑞興教授課題組在Aging (IF：4.831)雜志報(bào)道了《整合DNA甲基化和基因表達(dá)分析冠狀動(dòng)脈疾病的發(fā)病機(jī)制》。

作者進(jìn)行了(1)外周血樣本的全基因組DNA甲基化和mRNA表達(dá)譜分析，這些數(shù)據(jù)來自CAD樣本和對照組的GEO數(shù)據(jù)；(2)功能富集分析和差異甲基化基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建；(3) 11個(gè)感興趣的差異甲基化位點(diǎn)及其基因表達(dá)的驗(yàn)證試驗(yàn)（天昊目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法）；(4) DNA甲基化與mRNA表達(dá)數(shù)據(jù)的相關(guān)性分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)冠心病組中CXCL12低甲基化較少，而ITGB1、PDGFRB、PIK3R1的相對表達(dá)較低，CXCL12、ITGB1的甲基化與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。本研究明確了DNA甲基化與基因表達(dá)的相關(guān)性，并強(qiáng)調(diào)了CXCL12在CAD發(fā)病機(jī)制中的重要性。

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院金陵醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科徐格林教授課題組發(fā)現(xiàn)CDKN2B甲基化增加了主動(dòng)脈弓鈣化的風(fēng)險(xiǎn)，相關(guān)研究結(jié)果發(fā)表在J Atheroscler Thromb (IF：3.876)。

研究選擇缺血性腦卒中患者322例，其中存在主動(dòng)脈弓鈣化患者248例，無主動(dòng)脈弓鈣化患者74例。利用MethylTarget^?目的區(qū)域甲基化檢測技術(shù)檢測患者血液樣本CDKN2A/2B啟動(dòng)子區(qū)CpG島甲基化水平(共36個(gè)CpG位點(diǎn))。結(jié)果發(fā)現(xiàn)動(dòng)脈鈣化患者CDKN2B甲基化水平顯著高于不存在鈣化的缺血性腦卒中患者；CDKN2B甲基化水平與患者動(dòng)脈鈣化指標(biāo)對數(shù)轉(zhuǎn)換成正相關(guān)（矯正rs4977574的影響）。因此，CDKN2B高甲基化可能提示缺血性腦卒中患者有更高的動(dòng)脈弓鈣化風(fēng)險(xiǎn)。

浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科謝立平和劉犇團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)CCND1, NOP14和DNMT3B參與膀胱癌中miR-502-5p介導(dǎo)的細(xì)胞遷移和增殖抑制，論文發(fā)表在Cell Proliferation (IF：5.753)。
MiR-502-5p在膀胱癌中經(jīng)常下調(diào)，同時(shí)CpG島的高甲基化（目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法）導(dǎo)致miR-502-5p的下調(diào)。在功能上，過表達(dá)miR-502-5p在體外抑制細(xì)胞增殖和遷移，在體內(nèi)抑制腫瘤生長。CCND1、DNMT3B和NOP14被鑒定為miR-502-5p的直接靶點(diǎn)。有趣的是，DNMT3B和miR-502-5p在膀胱癌調(diào)控中建立了正反饋回路。此外，rescue實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證了miR-502-5p與其靶點(diǎn)之間的直接分子相互作用。這項(xiàng)研究提出并證明了miR-502-5p介導(dǎo)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在膀胱癌中至關(guān)重要。

浙江大學(xué)第一附屬醫(yī)院肝膽胰外科鄭樹森院士團(tuán)隊(duì)和張微教授團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)SOCS1通過降低細(xì)胞核中CyclinD1/CDK4復(fù)合物的穩(wěn)定性來阻斷肝細(xì)胞癌中G1-S期過渡，論文發(fā)表在Aging (IF：4.831)。

CDK蛋白家族的抑制劑已被批準(zhǔn)用于多種腫瘤的治療。然而，開發(fā)新藥物聯(lián)合CDK抑制劑有望提高治療效果。作者鑒定了細(xì)胞因子信號通路1 (SOCS1)抑制因子在肝細(xì)胞癌(HCC)細(xì)胞模型和異種移植小鼠模型中的作用。多個(gè)HCC細(xì)胞中SOCS1的甲基化水平顯著增加（目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法），導(dǎo)致其表達(dá)水平下降。當(dāng)人為上調(diào)SOCS1表達(dá)時(shí)，HCC細(xì)胞系在細(xì)胞周期G1-S過渡時(shí)被阻滯。有趣的是，在此過程中，CyclinD1總蛋白增加，但有效比例下降。進(jìn)而發(fā)現(xiàn)CyclinD1在細(xì)胞核中的缺失可能是由于P21的基于泛素降解導(dǎo)致細(xì)胞核CyclinD1的穩(wěn)定性下降，從而抑制了細(xì)胞周期向S期的發(fā)展。當(dāng)P21表達(dá)增加后，抑制CyclinD1活性的成分水平如預(yù)期的一樣下降，說明P21對腫瘤有部分促進(jìn)作用。SOCS1是預(yù)后、腫瘤大小和術(shù)后長期生存的良好指標(biāo)。SOCS1有望與CDK家族抑制劑聯(lián)合成為藥物靶點(diǎn)。

湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院李健老師課題組發(fā)現(xiàn)父方孕前不良飲食習(xí)慣對女性后代的代謝損傷影響可被雌性大鼠孕期葉酸治療過程逆轉(zhuǎn)，Diabetologia (IF：7.518)。

作者發(fā)現(xiàn)對于父方高脂-糖-鹽飲食組，其雌性后代表現(xiàn)明顯的葡萄糖耐受損傷，可能是肝組織一些關(guān)鍵代謝基因表達(dá)異常的外在體現(xiàn)。對于父方高脂-糖-鹽飲食組，其后代表現(xiàn)整體甲基化上升，但一些代謝核心基因的甲基化水平并無顯著變化（目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法）。雄性大鼠孕前不良飲食習(xí)慣對女性后代的代謝損傷影響可被雌性大鼠孕期葉酸治療過程逆轉(zhuǎn)。因此該研究提示母親孕期服用葉酸，可能能夠改善和治療父方孕前快餐飲食習(xí)慣對子代造成的表觀遺傳學(xué)不良影響。

浙江中醫(yī)藥大學(xué)江阿沛教授課題組發(fā)現(xiàn)DNA甲基化參與了治療雌性系統(tǒng)性紅斑狼瘡小鼠白芍總苷調(diào)控ERα，Journal of Pharmacological Sciences (IF：2.835)。

白芍總苷(TGP)是從白芍根部提取的生物活性化合物，已用于治療自身免疫性疾病。但TGP在自身免疫性疾病治療中的分子機(jī)制尚不清楚。ERα在SLE疾病中有促炎作用。在本研究中，作者發(fā)現(xiàn)TGP通過上調(diào)ERα啟動(dòng)子甲基化水平（目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法），顯著降低了ERα的表達(dá)。進(jìn)一步的研究表明，TGP治療可以增加狼瘡小鼠DNMT的表達(dá)。另外還使用了DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑來驗(yàn)證DNA甲基化是否參與了這些過程。HE染色結(jié)果顯示，TGP可減輕SLE小鼠腎損傷。TGP可抑制血清中IFN-g、IL6、IL12等細(xì)胞因子的表達(dá)及dsDNA水平。這些發(fā)現(xiàn)表明，TGP在SLE小鼠中抑制自身免疫可能是通過下調(diào)ERα的表達(dá)，而這可能是由于其能夠調(diào)節(jié)ERα啟動(dòng)子的甲基化狀態(tài)。

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物生理生化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室趙茹茜教授課題組于2017年12月在《Poultry Science》雜志（IF：2.659）上發(fā)表了補(bǔ)充甜菜堿促進(jìn)蛋雞類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白和卵黃沉積腎上腺皮質(zhì)酮表達(dá)的文章，在這項(xiàng)研究中使用了目的區(qū)域甲基化MethylTarget^?檢測方法。

課題組利用MethylTarget^?技術(shù)同年又在《Comparative Biochemistry and Physiology》雜志（IF：2.219）雜志上發(fā)表了母雞補(bǔ)充甜菜堿通過DNA甲基化修飾來調(diào)控F1代公雞下丘腦膽固醇代謝相關(guān)基因表達(dá)的文章。

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