Science重磅：腸道細(xì)菌可以提高腫瘤免疫治療效果

發(fā)稿時(shí)間：2020-09-30來源：天昊生物

英文題目: Microbiome-derived inosine modulates response to checkpoint inhibitor immunotherapy

中文題目：微生物源性肌苷調(diào)節(jié)檢查點(diǎn)抑制劑免疫治療的響應(yīng)

期刊名：Science

發(fā)表時(shí)間：2020年8月13日

單位: 加拿大卡爾加里大學(xué)卡明醫(yī)學(xué)院斯奈德慢性病研究所生理學(xué)與藥理學(xué)系

  有幾種腸道細(xì)菌與免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）療法的增強(qiáng)效果有關(guān)，但微生物組增強(qiáng)抗腫瘤免疫的潛在機(jī)制尚不清楚。在這里，我們分離出三種細(xì)菌，包括Bifidobacterium pseudolongum （假長(zhǎng)雙歧桿菌）,  Lactobacillus johnsonii（約氏乳桿菌）和Olsenella（齦乳桿菌），它們?cè)谒姆N小鼠癌癥模型中顯著地增強(qiáng)了免疫檢查點(diǎn)抑制劑（例如CTLA-4和PD-1）的功效。我們發(fā)現(xiàn)Bifidobacterium pseudolongum通過產(chǎn)生代謝物肌苷（inosine）來增強(qiáng)的免疫治療療效。免疫治療引起的腸道屏障功能下降增加了肌苷的全身系統(tǒng)轉(zhuǎn)運(yùn)和抗腫瘤T細(xì)胞的活化。肌苷的作用依賴于T細(xì)胞表達(dá)的腺苷受體A_2AR，并需要共刺激（例如CTLA-4抗體和CpG的共刺激）。總之，我們的研究確定了一種新的微生物代謝物免疫途徑，它被免疫療法激活，可用于開發(fā)基于微生物的輔助療法。

  免疫檢查點(diǎn)阻斷（ICB）療法（免疫檢查點(diǎn)是通過調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)來維持自身耐受并保護(hù)周圍組織的免疫抑制性通路，腫瘤細(xì)胞利用這一特性逃避免疫細(xì)胞的攻擊。目前研究最廣泛的兩個(gè)免疫檢查靶點(diǎn)即細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4 (CTLA-4)和PD-1受體。免疫檢查點(diǎn)抑制劑通過抑制免疫檢查點(diǎn)活性，釋放腫瘤微環(huán)境中的免疫剎車，重新激活T細(xì)胞對(duì)腫瘤的免疫應(yīng)答效應(yīng)，從而達(dá)到抗腫瘤的作用）可以利用免疫系統(tǒng)的治療潛力，對(duì)某些腫瘤和某些癌癥患者是一種有效的治療方法。細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（CTLA-4），程序性細(xì)胞死亡蛋白1（PD-1）或其配體（PD-L1）靶向藥已經(jīng)徹底改變了一些癌癥的治療，包括黑色素瘤、腎細(xì)胞癌和非小細(xì)胞肺癌。然而，許多其他癌癥顯示出對(duì)ICB治療的原發(fā)性抗藥性，并且免疫治療應(yīng)答率仍然很低，甚至ICB治療有效的那些癌癥患者之間也存在差異，因此，迫切需要確定這種免疫治療不應(yīng)答的根本原因。最近的研究提供了強(qiáng)有力的證據(jù)表明腸道微生物群可以影響抗腫瘤免疫，腸道微生物群的組成甚至可以預(yù)測(cè)ICB治療的療效。一系列開創(chuàng)性的研究表明，ICB療法的療效取決于特定的腸道細(xì)菌，使用促進(jìn)ICB菌治療可能有助于克服ICB治療的原發(fā)性耐藥性。盡管發(fā)現(xiàn)特定的細(xì)菌種類與增強(qiáng)抗腫瘤免疫有關(guān)，但這些微生物增強(qiáng)ICB治療的確切分子機(jī)制仍然不清楚。在這項(xiàng)研究中，我們利用大腸癌（CRC）的動(dòng)物模型來識(shí)別特定的促進(jìn)ICB療效的細(xì)菌，闡明這些微生物如何提高ICB治療效果的潛在分子機(jī)制，并在膀胱癌和黑色素瘤模型中驗(yàn)證了我們的發(fā)現(xiàn)。

  雖然腸道微生物群可以影響大腸癌的進(jìn)展，并可能改變化療的療效，但臨床上，ICB治療在大多數(shù)大腸癌病例中是眾所周知無效的，而且微生物群在無響應(yīng)中的作用尚未確定。因此，我們研究了ICB療法在小鼠模型中的療效，該模型使用偶氮甲烷（AOM）和葡聚糖硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)結(jié)腸腫瘤（圖1A）。值得注意的是，用CTLA-4抗體或PD-L1抗體治療可導(dǎo)致腫瘤明顯減少和變?。▓D1B和C），并降低腫瘤中上皮細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)志物EpCam⁺Lgr⁵⁺的細(xì)胞頻率（圖1D）。CTLA-4抗體治療還導(dǎo)致免疫細(xì)胞浸潤到腫瘤中（圖1E）。還觀察到腫瘤引流淋巴結(jié)中的CD8⁺T細(xì)胞頻率增加（圖S1A），脾臟中IFNγ⁺CD4⁺和IFNγ⁺CD8⁺T細(xì)胞增加（圖S1、B和C）。在此模型中，當(dāng)使用相同的抗體劑量時(shí)，CTLA-4抗體治療的作用要大于PD-L1抗體治療的作用。在這個(gè)模型中，CTLA-4和PD-L1抗體治療療效的差異可能取決于劑量-效應(yīng)關(guān)系，先前已針對(duì)PD1治療描述了更高的劑量。此外，CTLA-4和PD1/PD-L1抗體治療的效應(yīng)器功能依賴于不同的機(jī)制，其中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞和Treg的組成和功能在不同的癌癥類型和腸道腫瘤中都是不同的。 

  接下來，我們使用這個(gè)模型系統(tǒng)來篩選與ICB反應(yīng)相關(guān)的潛在有益細(xì)菌。雖然ICB治療組和對(duì)照組小鼠的糞便細(xì)菌組成（β-多樣性）沒有明顯變化（圖S1D），但少數(shù)細(xì)菌豐度卻有差異（圖S1E）。相比之下，腫瘤部位相關(guān)細(xì)菌群落的測(cè)序揭示了ICB治療組和對(duì)照組小鼠在β多樣性有差異（圖S1F），并且在ICB治療組的腫瘤中，一些額外的細(xì)菌豐度與對(duì)照組相比存在差異（圖1F和圖S1，G和H）。因此，我們對(duì)兩組的均質(zhì)化腫瘤進(jìn)行厭氧培養(yǎng)，能夠培養(yǎng)和鑒定出21個(gè)不同的細(xì)菌菌株：7種細(xì)菌僅從ICB治療組的腫瘤中培養(yǎng)得到，而4種細(xì)菌僅存在于對(duì)照組中（圖1G）。值得注意的是，Bifidobacterium pseudolongum（B. pseudolongum）（假長(zhǎng)雙歧桿菌）是僅從ICB治療組的腫瘤中培養(yǎng)出來的菌株之一，Bifidobacterium pseudolongum屬于Bifidobacterium（雙歧桿菌屬），經(jīng)測(cè)序鑒定其豐度存在差異（圖1F和圖S1、G和H）。有趣的是， Akkermansia muciniphila（A. muciniphila）最近被證實(shí)能增強(qiáng)PD-L1和PD-1抗體治療肺癌和腎癌的療效，它也是僅從ICB治療組的腫瘤中培養(yǎng)出來的七種細(xì)菌之一（圖1G）。分離和鑒定與ICB治療響應(yīng)相關(guān)的不同細(xì)菌為我們提供了一個(gè)機(jī)會(huì)來確定所涉及的分子機(jī)制。

  接下來，我們確定ICB治療大腸癌的療效是否依賴于微生物群。由于微生物群有限的動(dòng)物體內(nèi)原位腺癌的發(fā)生率嚴(yán)重降低，我們轉(zhuǎn)而采用異位體內(nèi)結(jié)直腸癌模型，將MC38結(jié)直腸癌細(xì)胞植入無菌（GF）或無特異性病原體（SPF）小鼠的側(cè)腹，一旦腫瘤可觸知，隨后進(jìn)行ICB治療（圖S2A）。與GF小鼠相比，抗CTLA-4治療導(dǎo)致腫瘤更?。▓DS2B），并顯著增加SPF中腫瘤內(nèi)和脾臟CD4+和CD8+T細(xì)胞的活化和增殖（圖S2，C到F）。與GF小鼠相比，在SPF小鼠CTLA-4抗體治療導(dǎo)致腫瘤更?。▓DS2B），并顯著增加腫瘤內(nèi)和脾臟CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞的活化和增殖（圖S2，C到F）。為了確保ICB療效的喪失不僅僅是GF小鼠不成熟免疫系統(tǒng)的反映，我們還評(píng)估了ICB治療在抗生素處理過的SPF小鼠中的效果（圖S2G），發(fā)現(xiàn)與GF小鼠相似，廣譜抗生素也降低了荷瘤SPF小鼠的ICB治療效果（圖S2，H至J），這說明某些微生物的存在能夠提高免疫治療的效果。

  為了評(píng)估在ICB治療小鼠腫瘤中富集的分離細(xì)菌（圖1G）是否能夠提高ICB治療的療效，我們將五種不同的分離細(xì)菌轉(zhuǎn)移到GF小鼠中，然后制造出了只有一種細(xì)菌定植的小鼠。將MC38腫瘤細(xì)胞異位注射到單菌定植的小鼠或GF小鼠中，在可觸見腫瘤發(fā)生后，對(duì)所有小鼠進(jìn)行CTLA-4抗體治療，并評(píng)估腫瘤生長(zhǎng)和抗腫瘤免疫（圖1H）。在所測(cè)試的五種細(xì)菌中，與GF小鼠或Colidextribacter和Prevotella單菌定植小鼠相比，B. pseudolongum, Lactobacillus johnsonii (L. johnsonii) （約氏乳桿菌）和Olsenella（齦乳桿菌）單菌定植小鼠顯著提高了CTLA-4抗體治療的效力（圖1I和J，圖S3A和B）。此外，在B. pseudolongum, Lactobacillus johnsonii和Olsenella單菌定植小鼠腫瘤中，CD4⁺和CD8⁺T細(xì)胞活化顯著增加（圖1K），而腫瘤內(nèi)CD8⁺T細(xì)胞（圖S3C和D）的增殖略有增加。與Colidextribacter對(duì)照菌相比，分離的促進(jìn)ICB療效的B. pseudolongum也提高了MC38異位腫瘤小鼠模型中PD-L1抗體治療的療效（圖S4），盡管療效程度低于CTLA-4抗體治療（相同劑量）的觀察結(jié)果，類似于我們?cè)贏OM/DSS模型中的觀察結(jié)果。由于B. pseudolongum對(duì)ICB治療的促進(jìn)作用最強(qiáng)，因此被選作進(jìn)一步的機(jī)理研究。值得注意的是，其他雙歧桿菌，如B. breve和B. longum，以前在小鼠黑素瘤模型中已被發(fā)現(xiàn)能促進(jìn)抗腫瘤免疫并增強(qiáng)PD-L1抗體治療的效力。在人類中，B. longum被報(bào)道富含PD1抗體的應(yīng)答者。此外，B. pseudolongum廣泛分布于哺乳動(dòng)物腸道中，許多不同的菌株表現(xiàn)出基因組多樣性和不同的代謝能力，表明其具有菌株依賴性功能。

  我們發(fā)現(xiàn)抗腫瘤免疫依賴于ICB治療，因?yàn)樵跊]有CTLA-4抗體治療的情況下，B. pseudolongum單菌定植小鼠不能減少腫瘤生長(zhǎng)（圖S5A到C）或誘導(dǎo)抗腫瘤免疫（圖S5D和E），重要的是，盡管先前的研究表明，一些細(xì)菌在腫瘤環(huán)境中積聚，在那里它們局部刺激免疫系統(tǒng)并通過有毒代謝物殺死腫瘤細(xì)胞，但我們無法在異位腫瘤中檢測(cè)到B.pseudolongum（圖S6），因此，盡管事實(shí)上最初是從腸道腫瘤中分離出B. pseudolongum，但在我們的模型中增強(qiáng)ICB治療療效并不需要腫瘤內(nèi)存在B. pseudolongum，這表明可溶性因子可能參與其中。

  盡管在沒有ICB治療的情況下B. pseudolongum不能誘導(dǎo)抗腫瘤免疫（圖S5），但B. pseudolongum在小腸固有層CD4 + T中誘導(dǎo)Th1主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子T-bet的表達(dá)顯著增加。在GF小鼠或Colidextribacter對(duì)照菌定植小鼠中未觀察到這個(gè)現(xiàn)象（圖2A和B），這說明B. pseudolongum即使在沒有ICB治療的情況下也具有一些免疫調(diào)節(jié)能力，但是在沒有ICB治療的情況下，這種影響僅限于腸道相關(guān)淋巴組織（GALT），在脾臟中沒有觀察到（圖2C）。在沒有ICB治療的情況下B. pseudolongum雖然可以誘導(dǎo)Th1主轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子T-bet的表達(dá)，但是沒有增加Th1細(xì)胞效應(yīng)器功能的激活，因?yàn)镮FN-γ⁺T-bet⁺細(xì)胞在任何被評(píng)估的組織中與對(duì)照組沒有區(qū)別（圖2B和C，以及圖S7A）。綜上，在沒有腫瘤和ICB治療的情況下，雖然B. pseudolongum促進(jìn)腸道相關(guān)淋巴組織（GALT）的Th1轉(zhuǎn)錄分化，但是沒有增加腸道和引流淋巴結(jié)的效應(yīng)功能。

  由于在沒有腫瘤和ICB治療的情況下B. pseudolongum單菌定植只誘導(dǎo)局部粘膜Th1分化，我們接下來想知道B. pseudolongum和CTLA-4抗體治療在沒有腫瘤的情況下是否會(huì)導(dǎo)致全身系統(tǒng)性的Th1活化。事實(shí)上，與GF小鼠或Colidextribacter對(duì)照菌定植小鼠相比，B. pseudolongum單菌定植聯(lián)合ICB治療可顯著增強(qiáng)脾臟Th1細(xì)胞活化和效應(yīng)器功能，IFN-γ的產(chǎn)生可證明這一點(diǎn)（圖2D和E以及圖S7H和I）。綜上，我們的結(jié)論是B. pseudolongum誘導(dǎo)Th1分化，并與CTLA-4抗體治療一起激活Th1效應(yīng)T細(xì)胞。

  我們對(duì)B. pseudolongum誘導(dǎo)Th1轉(zhuǎn)錄分化的能力和ICB治療后Th1效應(yīng)器功能激活的能力感興趣。胃腸道炎癥是CTLA-4抗體治療常見的免疫相關(guān)不良反應(yīng)，我們推斷這可能是由于腸道屏障完整性的降低,事實(shí)上，與對(duì)照組相比，用CTLA-4抗體治療的單菌定植動(dòng)物表現(xiàn)出全身血清抗體反應(yīng)增強(qiáng)，特別是Th1相關(guān)的IgG2b，并且小腸經(jīng)皮電阻降低（圖S8 A和B）。盡管如此， CTLA-4抗體治療并沒有引起明顯的局部或全身炎癥（圖S8、C和D），在這方面，有趣的是，一些雙歧桿菌已經(jīng)被報(bào)道為CTLA-4抗體誘導(dǎo)的小腸結(jié)腸炎提供保護(hù)，而不影響腫瘤生長(zhǎng)。由于CTLA-4抗體治療對(duì)缺乏B細(xì)胞和抗體的B. pseudolongum單菌定植小鼠也有效，因此ICB治療后誘導(dǎo)系統(tǒng)性細(xì)菌抗體對(duì)ICB的促進(jìn)作用并不是必須的（圖S9）。因此，由于細(xì)菌不在異位腫瘤中積聚（圖S6），CTLA-4抗體治療降低了腸道屏障的完整性（圖S8），并且B. pseudolongum的ICB治療促進(jìn)作用不需要B細(xì)胞和共生抗體（圖S9），我們假設(shè)代謝物的全身系統(tǒng)性易位增加可能是導(dǎo)致B. pseudolongum在ICB治療期間的能在全身起作用的原因。為解決這一問題，從經(jīng)過CTLA-4抗體治療的攜帶腫瘤的GF小鼠、B. pseudolongum或Colidextribacter單菌定植小鼠中收集血清，然后與CTLA-4抗體一起轉(zhuǎn)移到GF-MC38荷瘤小鼠中（圖2F）。值得注意的是，來自CTLA-4抗體治療的B. pseudolongum單菌定植小鼠的血清，而不是來自CTLA-4抗體治療的GF或Colidextribacter單菌定植小鼠的血清，足以減少腫瘤生長(zhǎng)，并在GF小鼠的腫瘤和脾臟中激發(fā)強(qiáng)的抗腫瘤免疫（圖2，G至I和圖S10）?？偠灾@些數(shù)據(jù)表明源自B. pseudolongum或由B. pseudolongum誘導(dǎo)的可溶性因子對(duì)ICB治療療效起到了促進(jìn)作用。

  血清樣本的非靶向代謝組學(xué)顯示，與GF小鼠或Colidextribacter對(duì)照菌定植小鼠相比，B. pseudolongum單菌定植小鼠血清中的幾種代謝物水平增加（圖2J和圖S11A和B）。值得注意的是，嘌呤代謝物肌苷是唯一的代謝物，與GF小鼠或Colidextribacter對(duì)照菌定植小鼠相比，B. pseudolongum單菌定植小鼠血清中肌苷inosine含量明顯更高（8至9倍）（圖2K）。值得注意的是，黃嘌呤和次黃嘌呤（肌苷的降解產(chǎn)物）在B. pseudolongum單菌定植小鼠血清中也升高（表S1）。對(duì)細(xì)菌培養(yǎng)上清液的分析表明，B. pseudolongum h和A. muciniphila產(chǎn)生的肌苷明顯高于Colidextribacter。在相同的培養(yǎng)條件下（圖S11C），揭示肌苷是由B. pseudolongum h和A. muciniphila產(chǎn)生的細(xì)菌代謝物。相反，雖然L. johnsonii不產(chǎn)生肌苷，但與Colidextribacter相比，它確實(shí)產(chǎn)生了大量的次黃嘌呤（圖S11D），次黃嘌呤是一種與肌苷結(jié)合到同一受體上的配體。

  為了測(cè)定肌苷在體內(nèi)的生理水平，我們測(cè)定了B. pseudolongum單菌定植小鼠十二指腸、空腸和盲腸中的肌苷含量。肌苷在十二指腸最高，沿胃腸道逐漸降低（十二指腸66.13±14.23μM>空腸29.26±9.38μM>盲腸0.5±0.05μM；圖S11F）。我們還定量了CTLA-4和PD-L1抗體治療的B. pseudolongum單菌定植小鼠清中肌苷的濃度（anti-CTLA-4:26.16±3.32μM，anti-PD-L1:37.5±10.2μM）和Colidextribacter單菌定植小鼠血清中肌苷的濃度（anti-CTLA-4:3.26±1.01μM，anti-PD-L1:4.8±1.3μM）（圖S11F），以及CTLA-4抗體治療前(4.08 ± 1.12 μM)和治療后SPF小鼠血清中肌苷的濃度（11.65±2.09μM），抗生素處理的SPF小鼠血清中肌苷的濃度（2.03±0.86μM；圖S11G）。這些數(shù)據(jù)表明，細(xì)菌在上消化道產(chǎn)生肌苷很可能是B. pseudolongum單菌定植小鼠全身肌苷水平升高的主要來源。

  為了測(cè)定肌苷在體內(nèi)的生理水平，我們測(cè)定了B. pseudolongum單菌定植小鼠十二指腸、空腸和盲腸中的肌苷含量。肌苷在十二指腸最高，沿胃腸道逐漸降低（十二指腸66.13±14.23μM>空腸29.26±9.38μM>盲腸0.5±0.05μM；圖S11F）。我們還定量了CTLA-4和PD-L1抗體治療的B. pseudolongum單菌定植小鼠清中肌苷的濃度（anti-CTLA-4:26.16±3.32μM，anti-PD-L1:37.5±10.2μM）和Colidextribacter單菌定植小鼠血清中肌苷的濃度（anti-CTLA-4:3.26±1.01μM，anti-PD-L1:4.8±1.3μM）（圖S11F），以及CTLA-4抗體治療前(4.08 ± 1.12 μM)和治療后SPF小鼠血清中肌苷的濃度（11.65±2.09μM），抗生素處理的SPF小鼠血清中肌苷的濃度（2.03±0.86μM；圖S11G）。這些數(shù)據(jù)表明，細(xì)菌在上消化道產(chǎn)生肌苷很可能是B. pseudolongum單菌定植小鼠全身肌苷水平升高的主要來源。

  肌苷的鑒定最初令人驚訝，因?yàn)榧≤张c腺苷2A受體（A_2AR）結(jié)合，已證明肌苷對(duì)體外Th1分化和體內(nèi)抗腫瘤免疫有抑制作用，事實(shí)上，支持腺苷和A_2AR結(jié)合后的免疫抑制作用的數(shù)據(jù)已經(jīng)導(dǎo)致了新的免疫檢查點(diǎn)抑制劑靶點(diǎn)的開發(fā)，例如靶向CD73、CD39和CD38的單克隆抗體，以及A_2AR的藥理拮抗劑，其中許多藥物目前正在臨床試驗(yàn)中。然而，一小部分文獻(xiàn)已經(jīng)證明肌苷類似物可以促炎，而A_2AR信號(hào)可以維持小鼠的Th1/抗腫瘤免疫?；谶@些相反的發(fā)現(xiàn)，我們研究肌苷是否可以促進(jìn)Th1細(xì)胞的體外分化。將活化的OVA _323-339肽脈沖骨髓源性樹突狀細(xì)胞（BMDCs）與原始OVA _323-339特異性O(shè)T-II CD4⁺T細(xì)胞共培養(yǎng)。有趣的是，肌苷在誘導(dǎo)或抑制CD4⁺Th1細(xì)胞分化方面的作用被證明是有條件的：具體地說，在外源性IFN-γ存在下，肌苷強(qiáng)烈地促進(jìn)了T細(xì)胞的Th1分化（圖3A），而在沒有IFN-γ的情況下，肌苷抑制Th1分化（圖3B和圖S12A）。

  接下來我們解析了肌苷促進(jìn)Th1分化的分子機(jī)制。盡管A_2AR信號(hào)的藥理抑制完全消除了肌苷的作用，但是細(xì)胞滲透性環(huán)腺苷酸（db-cAMP，一種A_2AR下游的信號(hào)分子），它的加入恢復(fù)了Th1的分化，并避開了對(duì)肌苷的需要（圖3A）。此外，抑制db-cAMP下游效應(yīng)分子蛋白激酶A（PKA）可抑制肌苷驅(qū)動(dòng)的Th1分化（圖3A）。此外，肌苷-A_2AR-cAMP-PKA信號(hào)級(jí)聯(lián)導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄因子cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白CREB的磷酸化（圖S12B），這是已知的Th1關(guān)鍵分化因子的轉(zhuǎn)錄促進(jìn)劑，如IL-12受體和IFN-γ，事實(shí)上，我們還觀察到肌苷依賴的IL12Rβ2上調(diào)（圖S12C）。

  肌苷的作用是T細(xì)胞固有的，因?yàn)榧词乖跊]有IFN-γ的情況下，向已被anti-CD3/anti-CD28-coated beads激活的單純T細(xì)胞中添加肌苷也能增強(qiáng)Th1分化（圖S12D） ）（圖S12D）。此外，當(dāng)肌苷刺激A_2AR缺陷型T細(xì)胞時(shí)，沒有誘導(dǎo)Th1分化和CREB磷酸化（圖S12，E和F），相反，通過使用db-cAMP避開了對(duì)A_2AR信號(hào)的需要，促進(jìn)了A_2AR缺陷型T細(xì)胞中Th1分化和CREB磷酸化，證實(shí)肌苷對(duì)Th1的促進(jìn)作用依賴于A_2AR信號(hào)（圖S12、E和F）。此外，由于已知pCREB可以與Th1關(guān)鍵靶基因結(jié)合，我們還證實(shí)肌苷刺激導(dǎo)致CD4⁺T細(xì)胞中Il12rb2和Ifng基因表達(dá)持續(xù)上調(diào)（圖S12、G和H）。重要的是，肌苷劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)顯示，在B. pseudolongum單菌定植小鼠而不是Colidextribacter單菌定植小鼠血清中觀察到的肌苷生理濃度足以誘導(dǎo)Th1活化（圖S12I）。為了證實(shí)肌苷介導(dǎo)的Th1體外促進(jìn)作用是否也適用于體內(nèi)條件，用卵清蛋白聯(lián)合CpG作為共刺激物免疫GF小鼠。值得注意的是，我們利用CpG作為一種共刺激物，因?yàn)樗且环N廣泛使用的抗腫瘤佐劑。一天后，小鼠腹腔注射肌苷或載體，肌苷增加了MLN中T-bet⁺IFN-γ⁺CD8⁺和T-bet⁺IFN-γ⁺CD4⁺T細(xì)胞的比例（圖S12，L到N），驗(yàn)證了我們的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

  接下來，我們確定B. pseudolongum對(duì)ICB治療療效的增強(qiáng)能力是否需要在T細(xì)胞上特異地表達(dá)A_2AR，在攜帶MC38腫瘤的B.pseudolongum單菌定植的Rag1缺陷小鼠中評(píng)估抗腫瘤免疫，該小鼠已通過A_2AR缺失或野生型T細(xì)胞轉(zhuǎn)移并用CTLA-4抗體治療（圖3C）。我們發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞上A_2AR表達(dá)的缺乏降低了B.pseudolongum對(duì)ICB治療療效的促進(jìn)作用（圖3，D和E）。

  然后，我們確定了肌苷是否可以在不存在B.pseudolongum的情況下促進(jìn)CTLA-4誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫力，用MC38腫瘤細(xì)胞激發(fā)GF小鼠，在可觸及的腫瘤上，口服或全身給予肌苷或PBS，并聯(lián)合CTLA-4治療和CpG作為共同刺激物（圖3F）。與PBS相比，口服和全身給藥肌苷與CTLA-4和CpG一起給藥可降低腫瘤重量并提高抗腫瘤免疫能力（圖3、G和H）。相反，在沒有CpG的情況下，肌苷增加了腫瘤重量，降低了抗腫瘤免疫能力（圖3，G和H），驗(yàn)證了我們先前的體外研究結(jié)果，即肌苷的作用是有條件的，并且取決于是否存在其它物質(zhì)的共刺激。肌苷誘導(dǎo)的抗腫瘤免疫也依賴于T細(xì)胞中的A_2AR信號(hào)，因?yàn)榭诜≤詹荒苷T導(dǎo)轉(zhuǎn)移了A_2AR缺失T細(xì)胞的MC38腫瘤無菌Rag1缺陷老鼠的抗腫瘤免疫（圖3，I到K）。這些數(shù)據(jù)表明，B.pseudolongum對(duì)ICB治療療效的促進(jìn)作用是由肌苷介導(dǎo)的，并且依賴于T細(xì)胞中特異的A_2AR信號(hào)。

  由于我們?cè)贗CB治療的腫瘤中檢測(cè)到A.muciniphila（圖1G），并且先前證明其可以提高ICB治療效果并在體外產(chǎn)生肌苷（圖S11C），因此我們進(jìn)一步研究了A.muciniphila是否也依賴于A_2AR信號(hào)來增強(qiáng)ICB治療效果。我們發(fā)現(xiàn)，A. muciniphila單菌定植結(jié)合CTLA-4抗體治療可導(dǎo)致更小的腫瘤并提高抗腫瘤免疫能力，這取決于A_2AR的T細(xì)胞表達(dá)（圖S13，A到D）。

  盡管L. johnsonii的單菌定植能夠促進(jìn)合CTLA-4抗體治療（圖1、I至K和圖S5）的抗腫瘤作用，但次黃嘌呤（A_2AR的另一配體）在體外培養(yǎng)中升高，而不是肌苷（圖S11，C和D）。盡管如此，L. johnsonii的ICB促進(jìn)作用雖然不如B. pseudolongum和A. muciniphila強(qiáng)，但也部分依賴于A_2AR的T細(xì)胞表達(dá)（圖S13，E至H）。

  接下來，我們測(cè)試肌苷在細(xì)菌復(fù)合物存在的情況下是否也能促進(jìn)CTLA-4抗體治療的療效。我們首先利用了gnotobiotic模型，在該模型中，小鼠被一個(gè)由12種細(xì)菌組成的微生物群（Oligo-MM 12）穩(wěn)定地定殖，該微生物群缺少B. pseudolongum。結(jié)果在Gnotobitic Oligo-MM 12小鼠中發(fā)現(xiàn)肌苷能夠促進(jìn)CTLA-4的抗腫瘤作用，腫瘤大小減小，腫瘤內(nèi)IFN-γ⁺CD8⁺和IFN-γ⁺CD4⁺T細(xì)胞增加（圖S14，A到D）。我們還發(fā)現(xiàn)肌苷可促進(jìn)SPF小鼠CTLA-4治療的效力，SPF小鼠含有高度多樣的微生物群（圖S14，E至H）。然后我們檢查B. pseudolongum增強(qiáng)抗CTLA-4的效力是否需要其有活性。盡管灌胃活的B. pseudolongum，無論是否經(jīng)過抗生素預(yù)處理，都增強(qiáng)了SPF小鼠的CTLA-4的效力（圖S14，E至H），但熱滅活的B. pseudolongum無法增強(qiáng)ICB治療的效果，可能是由于無法產(chǎn)生肌苷（圖S14，E至H）。

  肌苷除了直接刺激T細(xì)胞外，還可能通過改變腫瘤細(xì)胞存活率或T細(xì)胞介導(dǎo)殺傷的易感性潛在影響腫瘤細(xì)胞。然而，MC38腫瘤細(xì)胞在體外直接暴露于肌苷并不能調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的存活率（圖S15A），并且在與活化的腫瘤特異性T細(xì)胞共培養(yǎng)之前對(duì)MC38腫瘤細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理并沒有促進(jìn)或抑制T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤細(xì)胞殺傷（圖S15B），進(jìn)一步支持肌苷抗腫瘤作用主要通過T細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)論。

  綜合起來，這些數(shù)據(jù)表明肌苷對(duì)T細(xì)胞的作用需要足夠的共刺激，IL-12受體參與Th1分化和IFN-γ產(chǎn)生以獲得有效的抗腫瘤免疫。事實(shí)上，與巨噬細(xì)胞相比，傳統(tǒng)的樹突狀細(xì)胞（cDCs）被發(fā)現(xiàn)是IL-12的主要來源（圖S16，A和B）。為了進(jìn)一步評(píng)估樹突狀細(xì)胞（cDCs）在ICB-細(xì)菌聯(lián)合治療中的作用，將來自cDC-DTR小鼠的骨髓（BM）細(xì)胞轉(zhuǎn)移到致死性γ射線照射的受體SPF小鼠中，以允許cDC的誘導(dǎo)性條件耗竭。在骨髓（BM）重建后，用抗生素治療小鼠，并灌胃三種先前確定的促進(jìn)ICB的細(xì)菌的混合物，即B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella，10周后，將MC38細(xì)胞植入小鼠體內(nèi)，當(dāng)發(fā)現(xiàn)腫瘤時(shí)，通過注射白喉毒素和CTLA-4抗體治療消除樹突狀細(xì)胞（cDCs）（圖S16C）。cDCs的耗竭導(dǎo)致更大的腫瘤（圖S16D），腫瘤內(nèi)CD8⁺和CD4⁺T細(xì)胞頻率和IFN-γ產(chǎn)生顯著降低（圖S16E），顯著降低IFN-γ的產(chǎn)生和脾CD8⁺和CD4⁺T細(xì)胞的增殖（圖S16F）。因此，cDCs的耗盡大大降低了細(xì)菌誘導(dǎo)的ICB反應(yīng)而已建立的抗腫瘤效果，提示cDCs需要持續(xù)的抗原遞呈、IL-12的產(chǎn)生和T細(xì)胞的共刺激才能有效地進(jìn)行ICB治療，而cDCs和IL-12在PD-1抗體治療中的關(guān)鍵作用已被報(bào)道。

  由于增強(qiáng)Th1免疫通常被認(rèn)為對(duì)大多數(shù)抗腫瘤反應(yīng)是有益的，我們接下來確定在其它腫瘤模型中，用分離的促進(jìn)ICB療效的細(xì)菌進(jìn)行腸道定植或用肌苷治療是否同樣有效。首先，我們?cè)赟PF Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre動(dòng)物中測(cè)試了B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella的ICB療效促進(jìn)作用，這些動(dòng)物在腸上皮細(xì)胞中有條件地使Msh2（DNA錯(cuò)配修復(fù)基因）失活，并在小腸中發(fā)展出腺癌，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre模型中，單獨(dú)CTLA-4抗體治療（不添加ICB促進(jìn)細(xì)菌）導(dǎo)致腫瘤重量、腫瘤中EpCam⁺Lgr5⁺細(xì)胞和上皮細(xì)胞干細(xì)胞標(biāo)記物下降，腫瘤中T細(xì)胞活化和免疫細(xì)胞浸潤增加（圖S17，A至F）。與對(duì)照菌相比，同時(shí)添加ICB促進(jìn)細(xì)菌顯著增強(qiáng)了CTLA-4抗體治療的作用（圖S17G），導(dǎo)致腫瘤重量和EpCam⁺Lgr5⁺細(xì)胞進(jìn)一步減少，腫瘤中的T細(xì)胞活化和免疫細(xì)胞浸潤顯著增強(qiáng)（圖S17，H至L）。這些結(jié)果提示細(xì)菌聯(lián)合治療可以優(yōu)化錯(cuò)配修復(fù)缺陷（MMRD）腫瘤的治療方案。由于奧沙利鉑/PD-L1抗體聯(lián)合治療是臨床上更常用的治療方法，我們還證實(shí)了ICB促進(jìn)細(xì)菌增強(qiáng)了SPF Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre動(dòng)物奧沙利鉑/PD-L1抗體聯(lián)合治療的療效（圖S18）。由于B. pseudolongum在ICB治療動(dòng)物的AOM/DSS腫瘤中富集（圖1，F(xiàn)和G），而且B. pseudolongum先前與改善ICB治療癌癥患者的療效有關(guān)，我們想知道是否在ICB治療的SPF Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre動(dòng)物腫瘤中也富集了B. pseudolongum。結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然在CTLA-4或PD-L1抗體治療（圖S19A）后，腫瘤相關(guān)細(xì)菌總數(shù)沒有變化，但I(xiàn)CB治療導(dǎo)致腫瘤相關(guān)Bifidobacteria雙歧桿菌的特異性富集（圖S19B）。

  接下來，我們?cè)赟PF Apc^2lox14/+；Kras^LSL-G12D/+；Fabpl-Cre小鼠中檢測(cè)B. pseudolongum, L. johnsonii和Olsenella的ICB療效促進(jìn)作用，這些小鼠結(jié)腸細(xì)胞中具有條件性Apc缺乏和特異性激活Kras。在這個(gè)大腸癌模型中，與同型治療的動(dòng)物相比，CTLA-4治療并沒有提高存活率（圖S20，A和B），并且ICB促進(jìn)細(xì)菌的轉(zhuǎn)移也未能提高存活率（圖S20，C和D），這顯示了細(xì)菌聯(lián)合治療在該模型中的局限性。

  最后，我們測(cè)試細(xì)菌代謝物肌苷聯(lián)合共刺激是否足以提高ICB治療其它癌癥模型的療效。在SPF Msh2 ^{LoxP / LoxP} Villin-Cre小鼠中口服肌苷與CTLA-4和CpG治療可顯著降低腫瘤重量，并相應(yīng)增加脾臟IFN-γ⁺CD4⁺和IFN-γ⁺CD8⁺T細(xì)胞（圖4，A至F）。

  重要的是，還發(fā)現(xiàn)肌苷與CpG一起可有效提高抗CTLA-4在另外兩種癌（膀胱癌和黑素瘤）中的功效。具體來說，向注射了MB49鼠膀胱癌細(xì)胞的GF小鼠同時(shí)施加肌苷和CpG能夠顯著增強(qiáng)CTLA-4減輕腫瘤重量的能力，并增加了浸潤腫瘤的IFN-γ⁺CD4⁺和IFN-γ⁺CD8⁺T細(xì)胞的比例（圖4，G至K）。同樣，肌苷加CpG增強(qiáng)了黑色素瘤異位小鼠模型中CTLA-4介導(dǎo)抗腫瘤免疫的能力（圖4，L至P）。

  綜上所述，我們的結(jié)果確定了從ICB治療的結(jié)直腸癌腫瘤中分離出的B. pseudolongum(假長(zhǎng)雙歧桿菌)是一種關(guān)鍵的共生腸道細(xì)菌物種，它能夠促進(jìn)cDC(樹突狀細(xì)胞）依賴的Th1細(xì)胞回路，從而大大增強(qiáng)ICB療法在小鼠腸道和上皮性腫瘤模型中的效果（圖S21）。這些數(shù)據(jù)支持這樣一個(gè)前提，即用特定的微生物聯(lián)合體對(duì)微生物群進(jìn)行調(diào)整，可能為結(jié)直腸癌和其他癌癥的ICB治療提供一種有前途的輔助療法。雖然從老鼠身上分離出來，但這三種促進(jìn)ICB療效的細(xì)菌也在人類身上發(fā)現(xiàn)，這表明它們有轉(zhuǎn)化的潛力。此外，我們分析了已發(fā)表的人類糞便微生物組宏基因組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)趨勢(shì)，盡管并不顯著，但與無反應(yīng)的癌癥患者相比，ICB治療應(yīng)答者中B. pseudolongum的富集量高達(dá)2.4倍（圖S22A）。在屬水平上，與無應(yīng)答者相比，ICB治療應(yīng)答者中Bifidobacteria雙歧桿菌富集量高達(dá)5.9倍（盡管不顯著）（圖S22B），其中，B. longum和B. adolescentis明顯富集。由于在成人糞便樣本中B. pseudolongum的豐度較低，因此采用更大樣本量來證實(shí)這一趨勢(shì)。我們還確定肌苷是一種關(guān)鍵的細(xì)菌源性代謝物，通過T細(xì)胞特異性A_2AR信號(hào)以一種上下文依賴的方式（例如同時(shí)需要CTLA-4抗體和CpG的共刺激）促進(jìn)Th1細(xì)胞的激活。我們進(jìn)一步證實(shí)，已知對(duì)ICB治療有響應(yīng)的A. muciniphila是利用肌苷-A_2AR受體信號(hào)來傳導(dǎo)其對(duì)ICB治療的促進(jìn)作用。根據(jù)我們的研究結(jié)果，可能會(huì)警告癌癥免疫治療不要阻斷肌苷-A_2AR受體信號(hào)傳導(dǎo)，因?yàn)檫@可能會(huì)抵消有益微生物提供的任何積極作用。我們建議A_2AR受體信號(hào)傳導(dǎo)可能是細(xì)菌-ICB聯(lián)合療法不可或缺的抗腫瘤途徑，有必要進(jìn)一步研究黃嘌呤和次黃嘌呤（肌苷的降解產(chǎn)物）的作用。

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