喜訊！天昊生物微生物項目文章登陸《Environmental Pollution》

發(fā)稿時間：2020-09-22來源：天昊生物

水生環(huán)境中的重金屬（HMs）主要影響魚類，因此魚類是便捷的污染生物指示劑。此研究調(diào)查了重金屬（HMs）28天內(nèi)混合物（鉻（Cr）、鎘（Cd）、銅（Cu））在0-3.2mg/L濃度范圍內(nèi)對鯉魚的毒性作用。對重金屬積累，組織病理學(xué)，氧化應(yīng)激和腸道微生物變化進行了評估。 HMs的積累順序為Cr>Cu>Cd，主要在腎臟，最后是鱗片。直到第14天，所有暴露組中活性氧的產(chǎn)生均增加，最大產(chǎn)生量為3.2 mg / L混合物，后來在第28天下降。丙二醛和超氧化物歧化酶水平從第7天到第28天隨著重金屬（HMs）濃度的增加而增加，而總蛋白則呈相反的趨勢。鰓組織病理學(xué)改變主要表現(xiàn)為初級板層隆起、解體、次級板層縮短。腎臟表現(xiàn)為腎小球壞死、鮑曼囊擴張和腎小管間隙擴張。在0.8mg/L和3.2mg/L處理組中，Proteobacteria和 Firmicutes的豐度分別增加了59.4%和99.16%。本研究對多重重金屬（HMs）脅迫下鯉魚的生理和腸道菌群的變化有了更深入的了解。

魚類養(yǎng)護與實驗魚的選擇：

從甘肅省蘭州市當(dāng)?shù)佤~市場購買了150多個鯉魚標(biāo)本，這些標(biāo)本是從黃河（YR）的不同位置采集的。使魚在自然光周期（光照14小時/ 10小時黑暗周期）和環(huán)境溫度（20-25°C）下在玻璃水族箱中適應(yīng)至少兩周。魚的重量和長度分別在25-40g和12-15cm之間。在整個適應(yīng)過程中，每天用自來水更新水箱中50％的水，并連續(xù)通氣（pH = 8.12，溶解氧（DO）= 5.7 mg / L，總?cè)芙夤腆w= 346.4 mg / L，鹽度= 236 mg / L，電導(dǎo)率= 481.4 μS / cm）。用商業(yè)食品飼料（含有海藻粉、新鮮魚粉、蝦粉、小麥面筋和大豆圓酵母；粗蛋白：26%；粗纖維：8%；水分：10%；維生素：450毫克/千克），每天兩次（12:00和6:30）。喂食前使用ICP-OES確認(rèn)沒有重金屬（HMs）。每天監(jiān)測水質(zhì)pH值、溶解氧和溫度。選擇健康魚（未患?。┻M行下游實驗，通過一般外觀（如顏色、皮膚光澤、眼睛和行為）確認(rèn)。

重金屬暴露實驗裝置：

適應(yīng)兩周后，魚被分為5組（n=10）在5個不同的50L水箱中。4組添加了重金屬（HMs）混合物，剩余一組作為對照（不加HMs）。分析了從5個不同位置收集的黃河水樣品，以選擇本研究的HMs類型和濃度范圍。使用以下HMs和濃度：0 mg / L（對照），0.05 mg / L，0.2 mg / L，0.8 mg / L和3.2 mg / L K₂Cr₂O₇，CdCl ₂和CuSO₄ . 5H₂O。三種HMs中Cu的濃度最低（0.049mg/L），最高的是Cr（2.86mg/L）。每天，用含有相應(yīng)HMs濃度的自來水替換水箱中50%的水，以保持重金屬（HMs）水平并確保適當(dāng)?shù)乃|(zhì)。在整個實驗過程中，每天監(jiān)測pH值、溶解氧和溫度。

檢測組織中的重金屬：

將魚饑餓至少24 h，然后在冰上麻醉，解剖前記錄其長度和重量。每組中的三條魚在每個時間點被處死。在進一步分析之前，所有被解剖的魚組織都儲存在?20°C的溫度下，然后將組織首先凍干，在80°C下干燥過夜，隨后稱重肌肉、皮膚、鱗片、腸、鰓和腎臟樣本，并用4.5 mL濃硝酸和0.5 mL過氧化氫溶液（30%）預(yù)消化過夜，然后將樣品在蒸煮器中于175°C進一步消化2小時，隨后冷卻，過濾提取物，并使用Milli-Q純水將體積提高至25 mL，采用電感耦合等離子體發(fā)射光譜法檢查制備樣品中的HMs（Cr、Cd和Cu）。

組織病理學(xué)變化和氧化應(yīng)激檢測：

察鰓和腎組織的組織病理學(xué)變化和氧化應(yīng)激。解剖組織用4%中性緩沖甲醛溶液固定，光鏡觀察。固定后（至少18-24小時），將組織在梯度乙醇溶液中脫水并植入石蠟中，用旋轉(zhuǎn)切片機切割6μm厚的細(xì)切片，放置在玻片上，用蘇木精和伊紅（HE）染色，用DPX固定。為了測定氧化應(yīng)激，測定活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）和總蛋白（TP）活性，收集組織并在?80°C下立即保存在2?mL離心管中，直到進一步分析，樣品在0.89%冰鹽水中均質(zhì)，然后在12000×g下離心20min，樣品上清液用于ROS、SOD、MDA和TP生化分析：簡而言之，使用2?，7?-二氯熒光素二乙酸酯（DCF-DA）熒光探針在發(fā)射波長530?nm和激發(fā)波長485?nm處監(jiān)測ROS的產(chǎn)生；用羥胺法測定超氧化物歧化酶（U蛋白/mg）活性；采用2-硫代巴比妥酸（TBA）法測定MDA（nmol-protein/mg）；以牛血清白蛋白為參考標(biāo)準(zhǔn)，考馬斯亮藍(lán)G-250測定TP（g蛋白/L）。

高通量測序：

從每個水箱收集腸，并混合成一個樣本，分別在第7、14和28天收樣。從對照組、0.8 mg/L和3.2 mg/L水箱中收集樣品，將樣品轉(zhuǎn)移到含有磷酸鹽緩沖鹽水（PBS；pH=7.4）的2mL高壓滅菌管中，在?80°C下儲存，使用DNeasy Blood & Tissue kit（Illumina，USA）提取DNA，然后進行16S擴增子測序（V3-V4）。

鯉魚對重金屬（HMs）的吸收及由此引起的危害極為敏感，因此可以作為一個合適的污染指標(biāo)。高濃度下的HMs吸收（0.8 mg/L和3.2mg/L）引起嚴(yán)重的組織損傷、活性氧生成和腸道微生物群失調(diào)，影響其健康和生存。HMs暴露引起的腸道微生物群失衡可能是導(dǎo)致觀察到致死性的主要原因之一。Cr是最大吸收的重金屬（HMs），因此可能是中毒和腸道菌群變化的主要因素。本研究將進一步提供一個深入的研究范圍，以了解腸道微生物群與應(yīng)激源競爭的機制，以維持腸道功能和魚類健康。人類食用受重金屬污染的魚類會導(dǎo)致重金屬在人體內(nèi)的累積，導(dǎo)致類似的負(fù)面生理效應(yīng)，并可能導(dǎo)致死亡。因此，重金屬污染的魚類需要在人類食用前進行處理。

魚類組織對重金屬的吸收

暴露于Cr、Cd、Cu的混合物會導(dǎo)致魚類的異常行為，如食物排斥、糞便排泄減少、缺乏游泳協(xié)調(diào)性、向水面移動、鰓蓋快速但不規(guī)則的移動、以及一側(cè)持續(xù)靜止不動。這些行為在3.2mg/L組是極端明顯的，實驗18天后，該組的死亡率為100%，這種行為可能是神經(jīng)元活動受到抑制的結(jié)果。腸道微生物群的變化可能會改變魚類的生長、健康、性能、飼料效率和飼料轉(zhuǎn)化率。與對照組相比，各暴露組的重金屬（HMs）累積量有顯著差異。魚的HMs在第28天的累積順序為Cr>Cu>Cd，并經(jīng)常以魚中的腎臟>腮>腸>皮膚>肌肉>魚鱗的形式積累（圖1）。據(jù)報道，食用魚類中HMs的允許限量為：1 μg / g Cr，30 μg / g Cu和0.5 μg / g Cd。在第28天，暴露組的三個HMs都大大超過了允許的限值（圖1C、F、I、L、O和R）。HMs在魚類組織中的積累程度受魚類類型（年齡、屬和體重）和棲息地、水中金屬類別、水狀況（溫度、透明度和pH值）、溶解氧豐度和生理條件的調(diào)節(jié)。雖然不同器官/組織的吸收不同，但魚體內(nèi)金屬的主要進入途徑是鰓，魚類可以通過攝入的飼料和懸浮在水中的顆粒固體、通過親油性組織進行離子交換和皮膚吸附來吸收HMs。Cr在所有組織中的吸收量最大，其次是Cu 和Cd（圖1）。因此，Cr的過度沉積對人類食用此類魚類造成了非常高的風(fēng)險。與Cu 和Cd相比，高濃度Cr吸收主要有兩個原因：1）Cr更容易被吸收，因為它是一種強氧化劑，有更強的穿過細(xì)胞膜的傾向；2）pH值在6到8之間強烈影響生物利用度、敏感性和魚類對Cr（VI）的吸收。pH值7.8和6.5分別更適合Cr在內(nèi)臟和鰓中的積累，在這項研究中，水的pH值保持在7到8之間（圖S1）。Cu是哺乳動物和魚類必需的微量營養(yǎng)素（5-20 μg / g），但濃度過高會導(dǎo)致毒性，腸道中的Cu濃度在第14天和第28天達(dá)到0.02 mg / L的峰值（圖1K和L），因此可能沒有表現(xiàn)出顯著的毒性作用。除鰓在高濃度下（圖1 M、N和O），Cd在所有部位的吸收最少，這與別人觀察到斑馬魚鰓中Cd積累較多的研究相似。

腎臟樣品中的HMs積累經(jīng)常是最高的（圖1P和Q），因為它是使污染物排毒以減輕有害影響的器官。腎臟在第28天的累積水平略有下降，這可能是由于HMs引起的腎臟損傷。因此，與Cu和Cd相比，Cr是吸收最活躍的HMs。

圖1 暴露7、14和28天時，肌肉、皮膚、鱗片、腸道、鰓和腎臟對重金屬的吸收。

鰓和腎臟的組織病理學(xué)變化

與對照組相比，HMs混合物對鰓和腎臟的損害作用顯著，基本上是在暴露14天和28天后（圖2）。對照組鰓的組織病理學(xué)分析顯示正常，其特征是存在初級板層（PL）、次級板層（SL）和層間層（IL）。與此相反，暴露組的鰓有組織異常，包括初級板層融合、初級板層剝離和隆起、血管損傷、層間層變薄、充血、次級板層縮短和組織破裂，這表明廣泛的組織損傷（圖2）。在0.05 mg / L組中，直到第14天變化并不十分明顯，但在第28天損害明顯（圖2B）。在0.2 mg / L組中（圖2C），與0.05 mg / L組相比，變化更為明顯，并且在第28天更為離散；在高濃度下，變化更為明顯，在第28天，這種損害在0.8 mg / L組中普遍存在（圖2D）；而在3.2 mg / L組中，從第7天起就非常明確（圖2E）。銅的主要積累器官是肝臟，因此在本研究中，銅對鰓和腎組織沒有明顯的影響。

圖2 暴露7、14和28天鰓的組織病理學(xué)變化：A）對照組：正常組織外觀，顯示清晰的初級板層（PL）、次級板層（SL）和層間層（IL）；B）0.05 mg/L：血管受損（DBV）、板層融合（LF）和初級板層隆起（UPL）；C）0.2 mg/L：充血（CN），隆起原發(fā)性板層（UPL）、原發(fā)性板層崩解（DPL）、層間層（IL）變?。^）；D）0.8 mg/L：次級板層縮短（SSL）、板層崩解（LD）、廣泛組織損傷，表現(xiàn)為板層變薄、完全板層破裂（LR）和IL（箭頭）變??；E） 3.2mg/L：次級板層縮短（SSL）、層間層（IL）變?。^）、初級板層隆起（UPL）、IL破裂（ILR）。

腎臟是最早受到污染物影響的器官之一，在消除有害物質(zhì)方面非常重要。HMs暴露后，腎臟結(jié)構(gòu)被破壞，表現(xiàn)為腎小球壞死（GN）、腎小管間隙擴張、腎小管充血、腎小管變性和鮑曼囊擴張。盡管0.05 mg/L和0.2 mg/L組的腎小球壞死（GN）并不明顯，但0.8 mg/L和3.2 mg/L組顯示出顯著變化（圖3），這些變化，包括鮑曼氏囊變性，腎小球腎炎，腎小管管腔減少。0.05 mg/L組在第28天的損傷更為突出（圖3B）；0.2 mg/L組在暴露14天時損傷更為明顯（圖3C）；0.8mg/L組損傷強度在第28天最高，在第7天和第14天稍低（圖3D）；在3.2 mg / L組中，從第7天起破壞就很強烈（圖3E）。這表明HMs可以破壞組織結(jié)構(gòu)，并且隨著HMs濃度的增加，破壞作用增加，因此，組織病理學(xué)變化可以指示環(huán)境污染。

圖3 暴露第7、14和28天腎臟的組織病理學(xué)變化：A）對照組：正常組織外觀，顯示明確的腎小球（G）、初級小管（PT）、遠(yuǎn)端小管（DT）和小管間隙（TS=橢圓形）；B）0.05 mg/L：腎小球（G），TS直徑減小（#），TS擴張（*）；C） 0.2 mg/L：腎小管充血（CT）、腎小球（GN）、TS直徑減?。?/span>#）、變性小管（箭頭），以及TS擴張（*）；D）0.8 mg/L：腎小球壞死（GN），TS直徑減?。?/span>#），退行性小管（箭頭），小管間隙擴張（*），鮑曼囊擴張（+）；E）3.2 mg/L：腎小球壞死（GN），TS直徑減小（#），變性小管（箭頭），小管間隙擴張（*），鮑曼囊擴張（+）。

重金屬混合物對抗氧化脅迫的影響

與對照組相比，暴露組的活性氧（ROS）、超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）顯著增加，而總蛋白（TP）降低（圖4）。腎臟中的ROS生成比鰓更普遍，從暴露的第7天到第14天增加，但在第28天減少（圖4A）。HMs通過取代原始金屬離子結(jié)合蛋白質(zhì)基團的能力，導(dǎo)致酶失活和產(chǎn)生ROS（超氧自由基、羥基自由基和過氧化氫），這可能導(dǎo)致膜脂過氧化、基因組突變、酶活性降低、蛋白質(zhì)降解和氨基酸氧化。在第7天和第14天，SOD生成量沒有顯著增加，但在第28天增加（圖4B）。超氧化物歧化酶（SOD）有助于將過氧化氫轉(zhuǎn)化為氧氣和水，從而防止ROS積聚，ROS的減少和SOD水平的增加（圖4）表明魚類清除ROS和減少氧化損傷水平的能力更強。在所有暴露組中，丙二醛（MDA水平以時間和劑量依賴的方式增加（圖4C）。丙二醛（MDA）是脂質(zhì)過氧化物（LPO）的一個指標(biāo)，反映自由基損傷的程度。HMs可對細(xì)胞膜產(chǎn)生負(fù)面影響，從而通過LPO刺激改變生理學(xué)，ROS的形成使細(xì)胞MDA水平波動，MDA濃度增加與活性氧濃度下降相關(guān)。蛋白質(zhì)是魚類必需的能量來源，當(dāng)受到壓力時，魚類可能通過氨基酸氧化利用更多的蛋白質(zhì)，總蛋白（TP）與MDA呈相反趨勢（圖4D）。在壓力下，由于食物攝入減少、組織修復(fù)、體內(nèi)平衡和解毒機制減少，蛋白質(zhì)水平可能會降低。隨著暴露時間和HMs濃度的增加，TP的減少與先前的研究類似。因此，高濃度的HMs會導(dǎo)致自由基的形成，從而增加損傷強度。

圖4 暴露7、14和28天后鰓和腎臟的氧化應(yīng)激變化：A）活性氧（ROS）；B）超氧化物歧化酶（SOD）；C）丙二醛（MDA）；D）總蛋白（TP）。

腸道微生物群落組成的變化

腸道微生物群在維持生物體的健康、生長和發(fā)育中起著至關(guān)重要的作用，這些微生物群可能會受到各種環(huán)境因素的不平衡，因此在毒理學(xué)研究中很重要。在本研究中，對照組中門的相對豐度沒有顯著變化，但0.8 mg/L和3.2 mg/L組從第7天到第28天出現(xiàn)了極端變化（圖5A）。在第7天，0.8mg/L組以Fusobacteria（76.24%）為主，其次是Proteobacteria (12.38%)，Firmicutes(8.5%)， Bacteroidetes (1.59%)；在3.2mg/L組中，Proteobacteria百分比最高（82.45%），其次是Fusobacteria (8.61%)，Firmicutes (3.54%)，Bacteroidetes (3%)。在第14天，0.8mg/L組Proteobacteria（59.4%）增加，Fusobacteria（31.25%）減少，Firmicutes (6.99%) 和Bacteroidetes (2.07%)無明顯變化；3.2mg/L組除Firmicutes（99.16%）外，上述菌門均消失。在第28天，0.8 mg/L組的特征菌是Proteobacteria（49.94%）、Actinobacteria (40.95%)和Firmicutes (3.76%)，但Fusobacteria和Bacteroidetes消失（圖5A）。

暴露組的Firmicutes/Bacteroidetes比率受到干擾，這與先前的鯉魚暴露于Cu的研究結(jié)果一致。在第14天（3.2mg/L組），Firmicutes占大多數(shù)，因為腸道菌群豐度非常低（圖S2a），這一觀察結(jié)果可能表明，在極端Cr濃度下，Firmicutes是最具抗藥性的類群，但其它類群的耐受性有限。研究表明Firmicutes是一種碳水化合物發(fā)酵群，產(chǎn)生丁酸鹽，主要為上皮細(xì)胞和胃腸道細(xì)胞提供營養(yǎng)和能量，提高粘液產(chǎn)量，起到抗癌和抗炎作用，其耗盡可能會損害腸道屏障的完整性，因此，高比例的Firmicutes（圖5A）可能表明魚類需要通過保持腸道屏障功能來維持健康，而Bacteroidetes與營養(yǎng)吸收、上皮細(xì)胞成熟和維持有關(guān)。有研究表明在低Cu濃度（高達(dá)0.28 mg/L）下，發(fā)現(xiàn)鯉魚體內(nèi)主要存在Proteobacteria、Fusobacteria、Verrucomicrobia、Bacteroidetes，而尼羅羅非魚（1 mg/L Cd）中，分別在暴露8周和4周后，Bacteroidetes 和Proteobacteria占優(yōu)勢，這表明，在本研究中發(fā)現(xiàn)的腸道微生物群變化主要是由鉻（Cr）引起的，因為鉻主要被魚吸收（圖1）。在第28天，0.8 mg/L組出現(xiàn)Actinobacteria（圖5A），Actinobacteria可以產(chǎn)生對病原微生物有活性的次級代謝產(chǎn)物，它的出現(xiàn)可能表明該組中的魚易感染病原微生物。

在屬水平上，在對照組和0.8 mg/L（第7天和第14天）組中主要檢測到Cetobacterium，而在第14天3.2 mg/L組中，Lactococcus和Enterococcus普遍存在（圖5B）。Enterococcus和Lactococcus與Cr無顯著相關(guān)性，但與Cd、Cu呈正相關(guān)。相反，Bacteroides、Chitinibacter、Luteolibacter與Cr、Cd和Cu呈負(fù)相關(guān)（圖S3），表明它們在所有暴露組中消失（圖5B）。研究表明Cetobacterium和Lactococcus分別參與維生素B12的合成和葡萄糖發(fā)酵；Lactococcus在溫水（>20°C）和冷水（4-10°C）中可占優(yōu)勢，而Bacteroides可在腸道內(nèi)出現(xiàn)每日波動；Lactococcus產(chǎn)生細(xì)胞外產(chǎn)物，如乳酸、過氧化氫、二氧化碳、抗生素肽/蛋白質(zhì)和有機酸，以抵御潛在病原體。因此，上述數(shù)據(jù)表明，重金屬暴露導(dǎo)致腸道微生物失調(diào)，然而，益生菌可以通過腸道定植穩(wěn)定腸道微生物群來防止失調(diào)，潛在的益生菌，如Bacillus sp.和Enterococcus sp.，可顯著提高魚類的飼料利用率或轉(zhuǎn)化率、生長性能、免疫力、消化酶和抗氧化酶活性，以及抗病性。

圖5 對照組、0.8 mg/L和3.2 mg/L組在7、14和28天，重金屬暴露對腸道菌群的影響：a）在門水平鑒定的腸道微生物群的相對豐度；b）顯示屬水平的細(xì)菌熱圖。

在第7天，所有組共有70個OTU，而在第14天和第28天，所有組中分別共有72個和96個OTU（圖6A、B、C）。

圖6 維恩圖顯示了對照組、0.8 mg/L和3.2 mg/L組在7天（A）、14天（B）和28天（C）的特異和共有的OTUs。

目前的研究表明，重金屬（HMs）對魚類是有毒的，鉻（Cr）是其中毒性最大的。魚體內(nèi)高鉻的積累使其不適合人類食用。低濃度暴露會改變魚類的生物學(xué)參數(shù)，但長期高濃度暴露會導(dǎo)致死亡。重金屬吸收隨重金屬濃度的增加而增加。損傷程度隨著時間和重金屬劑量的增加而增加，引起極端的組織損傷、ROS生成和腸道微生物失調(diào)。高濃度重金屬混合物（0.8 mg/L和3.2 mg/L）對組織和腸道有害。3.2mg/L的混合液引起最大限度的ROS生成和腸道微生物失調(diào)。需要進一步研究重金屬混合物對魚類的影響，特別是腸道微生物的變化。未來的研究可以揭示重金屬在魚類中的毒性機制。