天昊16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序項(xiàng)目新文：金針菇β-型糖苷多糖對(duì)結(jié)腸炎小鼠的抗炎及腸道菌群調(diào)節(jié)作用

發(fā)稿時(shí)間：2020-09-16來(lái)源：天昊生物

本研究以金針菇多糖（FVP）為研究對(duì)象，研究其對(duì)葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的潰瘍性結(jié)腸炎（UC）模型小鼠的改善作用。用16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)測(cè)定小鼠糞便中腸道微生物的絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度。結(jié)果表明，FVP治療可減輕UC癥狀，上調(diào)或下調(diào)結(jié)腸組織中相關(guān)基因表達(dá)水平，并可增強(qiáng)UC小鼠的代謝和生物合成能力。采用相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)11種腸道微生物包括乳酸桿菌、雙歧桿菌和梭狀芽孢桿菌與UC癥狀相關(guān)。這些結(jié)果表明，FVP可通過(guò)調(diào)節(jié)特定腸道微生物而減輕小鼠UC癥狀，提高了對(duì)FVP作為益生元的功能活性的認(rèn)識(shí)。

  潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。?/span>CD）是炎癥性腸病（IBD）的兩種形式，具有相似的觸發(fā)因素，兩者都被歸為慢性炎癥反應(yīng)，由腸功能不全引起。兩者的區(qū)別在于，克羅恩病發(fā)生在胃腸道的任何部位，尤其是回腸末端，而UC主要發(fā)生在結(jié)腸。UC是一種與宿主遺傳、免疫功能紊亂和環(huán)境變化有關(guān)的間歇性炎癥反應(yīng)。葡聚糖硫酸鈉（DSS）能破壞腸黏膜屏障的完整性，激活巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子，最終誘發(fā)UC。DSS誘導(dǎo)的UC小鼠是一種典型的模擬人類(lèi)腸道炎癥性疾病癥狀的模型，包括黏膜蛋白損傷、腸潰瘍、腹瀉、結(jié)腸縮短和便血，用于研究不同生物活性成分對(duì)腸道健康的影響。

  生物大分子存在于中藥、植物和食用菌中，具有腸道微生物調(diào)節(jié)等多種生理功能。生物大分子物質(zhì)與腸道微生物的相互作用，直接導(dǎo)致腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的改變，進(jìn)而影響相關(guān)功能酶和蛋白質(zhì)的表達(dá)，這種生理變化與代謝性疾病和炎癥性疾病密切相關(guān)。根據(jù)報(bào)道，代謝性疾病的發(fā)生或發(fā)展與腸道微生物及其代謝產(chǎn)物的生理活動(dòng)密切相關(guān)，如肥胖和2型糖尿病。更重要的是，腸道微生物與腸道炎癥和癌癥有關(guān)，如UC和結(jié)腸癌。一項(xiàng)研究表明，枸杞花色苷可通過(guò)調(diào)節(jié)腸道相關(guān)蛋白的表達(dá)，改變腸道菌群結(jié)構(gòu)，改善DSS誘導(dǎo)的UC小鼠癥狀。黃芪多糖能改善DSS誘導(dǎo)的UC小鼠結(jié)腸組織學(xué)評(píng)分，增加體重和結(jié)腸長(zhǎng)度，降低NF-κВ DNA磷酸化活性，是治療IBD的天然途徑。石斛多糖具有減輕潰瘍性結(jié)腸炎（UC）小鼠結(jié)腸組織病理?yè)p傷和重建炎性細(xì)胞因子平衡的作用。

  金針菇是我國(guó)傳統(tǒng)食用菌，具有栽培歷史悠久、工業(yè)化生產(chǎn)率高等特點(diǎn)，在我國(guó)消費(fèi)廣泛。以往的研究為金針菇多糖具有調(diào)節(jié)腸道微生物群的能力提供了佐證，同時(shí)，這種不含淀粉的生物活性多糖，通過(guò)調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，也顯示出一定的免疫調(diào)節(jié)活性。本實(shí)驗(yàn)室的前期研究表明，金針菇多糖（FVP）能調(diào)節(jié)腸道菌群，增加血清免疫球蛋白和細(xì)胞因子，提示FVP在腸道內(nèi)的發(fā)酵過(guò)程可能代表了一種免疫調(diào)節(jié)能力，總之，FVP具有了調(diào)節(jié)腸道微生物群和改變免疫反應(yīng)的能力。但從以往的研究來(lái)看，只是證明了FVP對(duì)腸道菌群和宿主免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)作用，沒(méi)有證據(jù)表明健康小鼠腸道微生物發(fā)生了有益的變化。由于免疫應(yīng)答與炎癥反應(yīng)的相關(guān)性，有必要研究FVP對(duì)腸道炎癥的影響。然而，關(guān)于FVP對(duì)腸道炎癥的影響的信息很少。因此，闡明FVP與潰瘍性結(jié)腸炎（UC）腸道微生物介導(dǎo)的抗炎作用的關(guān)系至關(guān)重要。

  作為填補(bǔ)我們知識(shí)空白的一步，本研究評(píng)估了FVP對(duì)UC小鼠的抗炎作用，結(jié)腸組織學(xué)改變，促炎細(xì)胞因子含量，相對(duì)mRNA表達(dá)，與炎癥相關(guān)的特定腸道微生物種類(lèi)都被考慮在內(nèi)。我們假設(shè)這種具有β-型糖苷鍵和呋喃糖環(huán)的非淀粉多糖可能通過(guò)調(diào)節(jié)腸道微生物群來(lái)改變宿主的代謝功能，從而達(dá)到抗炎的目的。

FVP：

從新鮮金針菇中獲得FVP，FVP由81.01%的多糖、7.07%的單糖、1.80%的總酚組成，由甘露糖、葡萄糖、木糖、阿拉伯糖和巖藻糖連接而成。此外，這種具有β-型糖苷鍵和呋喃糖環(huán)的非淀粉多糖（特征吸收率為888.20cm^?1和1037.08cm^?1），分別由7473.14 KDa（48.09%）和15.077 KDa（51.91%）組成。

動(dòng)物喂養(yǎng)試驗(yàn)：

4周齡C57BL/6J雄性小鼠（SPF級(jí)，20±2g，n=48）購(gòu)自南京醫(yī)科大學(xué)，實(shí)驗(yàn)程序在南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物中心進(jìn)行。每只小鼠適應(yīng)新的25±2°C的生活環(huán)境和12/12h的光暗循環(huán)7天。所有小鼠均飼喂半純和日糧，飼料成分見(jiàn)表S1。7天后，將小鼠隨機(jī)分為4組（SD、SD-FVP、DSS、DSS-FVP）：SD組和SD-FVP組在實(shí)驗(yàn)期間給予純水。在DSS組和DSS-FVP組，在第7-11、18-22、29-33、41-44天用1.5%葡聚糖硫酸鈉（DSS）鹽代替純水。SD-FVP和DSS-FVP組在實(shí)驗(yàn)期間每天灌胃給予FVP（400mg/kg體重）。在SD、DSS組，小鼠灌胃給予蒸餾水作為對(duì)照（圖1A）。每天灌胃給藥后，每只小鼠稱(chēng)重，以調(diào)整第二天灌胃喂養(yǎng)（0.1mL/10g體重）的給藥量。所有的老鼠都是在免費(fèi)獲得食物和水的情況下飼養(yǎng)的，每周記錄飼料消耗量。疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分由體重減輕程度、大便稠度和便血情況決定。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，所有小鼠在二氧化碳吸收麻醉后頸椎脫位處死，測(cè)量結(jié)腸長(zhǎng)度，取血清及各臟器（腦、肝、腎、盲腸、結(jié)腸），于-80℃保存至檢測(cè)。所有動(dòng)物程序均按照NIH（2011年）《實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物護(hù)理和使用指南》中的指南進(jìn)行，所有處理均得到南京農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)文號(hào)：SYXK (SU) 2017-0007。

結(jié)腸組織的組織學(xué)分析：

切除的結(jié)腸立即用4%中性福爾馬林固定。組織病理學(xué)分析：取標(biāo)本用乙醇脫水，石蠟包埋切片，二甲苯脫蠟10min，蘇木精伊紅染色觀察。所有組織切片均采用盲法評(píng)估。切片根據(jù)炎癥浸潤(rùn)程度（0-5）、隱窩損傷程度（0-4）、潰瘍程度（0-3）和水腫有無(wú)（0或1）進(jìn)行評(píng)分。

細(xì)胞因子測(cè)定：

采用ELISA試劑盒測(cè)定血清中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、干擾素-γ（IFN-γ）、白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（MIP-1α）的含量。

盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs濃度的測(cè)定：

采用氣相色譜分析（GC）測(cè)定小鼠盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFAs的濃度，包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸。簡(jiǎn)而言之，采集的樣品用H₂ SO ₄和二乙基進(jìn)行預(yù)處理。使用Agilent 7890A氣相色譜儀進(jìn)行氣相色譜分析。具體而言，在0.025-0.8mol/L范圍內(nèi)繪制乙酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線，在0.00125-0.4mol/L范圍內(nèi)添加4-甲基戊酸作為內(nèi)標(biāo)，繪制丙酸、異丁酸、正丁酸、戊酸和正戊酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線。每個(gè)樣品分為三份。

RNA提取及相關(guān)基因表達(dá)：

用Trizol提取小鼠結(jié)腸總RNA。使用SMA2000超微量紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為管家基因，用2^-ΔΔCt計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平。

糞便DNA提取及高通量測(cè)序：

使用E.Z.N.A.? Bacterial DNA Kit提取小鼠糞便細(xì)菌總DNA，DNA樣本送至上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序（V3-V4）。

FVP可減輕UC的嚴(yán)重程度

體重、攝食量、耗水量、疾病活動(dòng)指數(shù)評(píng)分、結(jié)腸長(zhǎng)度和臟器相對(duì)重量的變化如圖1所示。SD組和SD-FVP組的體重（圖1B）呈上升趨勢(shì)，而DSS組和DSS-FVP組在最后兩個(gè)周期（29-33天、41-44天）后體重呈下降趨勢(shì)，且DSS組較其它組有顯著下降趨勢(shì)（P＜0.05）。同時(shí)，疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）（圖1E）顯示，在第一個(gè)周期中，DSS飲用水處理前（0-6天），小鼠的糞便出現(xiàn)形成，沒(méi)有腹瀉和便血；在DSS飲用水處理后（7-11天），DSS組的糞便開(kāi)始軟化，盡管DSS-FVP組的DAI評(píng)分高于對(duì)照組SD，但低于DSS組。在停止DSS處理后的恢復(fù)期（12-17天），DSS組和DSS-FVP組小鼠糞便恢復(fù)到健康水平。第22天，DSS組小鼠再次給予DSS處理后，出現(xiàn)輕度便血。第33天，隨著攝食量的減少，DSS組小鼠出現(xiàn)體重減輕，并伴有嚴(yán)重腹瀉和便血癥狀。第44天，DSS組小鼠出現(xiàn)腹瀉、便血和攝食量減少，但經(jīng)FVP給藥后，DSS-FVP組UC癥狀明顯減輕，與DSS組比較差異有顯著性（P＜0.05）。對(duì)DSS組和DSS-FVP組小鼠在DSS處理期間的耗水量進(jìn)行計(jì)數(shù)，結(jié)果顯示無(wú)顯著性差異（P﹥0.05）（圖1D）。四組小鼠結(jié)腸長(zhǎng)度如圖1 F所示，DSS組結(jié)腸長(zhǎng)度較SD和SD-FVP組短（P＜0.05），但經(jīng)FVP給藥后，UC引起的結(jié)腸縮短癥狀有所減輕（與SD和SD-FVP組相比，P＜0.05）。

FVP減輕組織學(xué)改變

小鼠結(jié)腸組織的組織學(xué)變化如圖2所示。SD組和SD-FVP組生理形態(tài)正常，無(wú)炎癥反應(yīng)和上皮細(xì)胞損傷。DSS處理后的小鼠結(jié)腸杯狀細(xì)胞和淺表上皮細(xì)胞均消失，單核白細(xì)胞浸潤(rùn)。經(jīng)FVP治療后，DSS-FVP組病理?yè)p傷明顯減輕，大部分杯狀細(xì)胞保持正常生理形態(tài)，炎癥反應(yīng)明顯減輕，具體反映在組織學(xué)評(píng)分中（圖2 I）。

FVP可降低結(jié)腸組織和血清中的細(xì)胞因子

結(jié)腸組織和血清中促炎細(xì)胞因子（包括TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、MCP-1和MIP-1α）如圖3所示。與SD組相比，DSS組大鼠結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子顯著升高（P＜0.05），FVP治療后，DSS-FVP組TNF-α、IL-6、MCP-1和MIP-1α水平低于DSS組（P＜0.05），與SD、SD-FVP組相似。DSS組和DSS-FVP組IFN-γ和IL-1β表達(dá)水平無(wú)顯著性差異。除細(xì)胞因子TNF-α外，血清中也有類(lèi)似的變化趨勢(shì)。提示FVP可降低UC致炎性細(xì)胞因子的升高。

FVP調(diào)節(jié)結(jié)腸組織中相關(guān)mRNA的表達(dá)

FVP對(duì)結(jié)腸促炎細(xì)胞因子和緊密連接蛋白mRNA表達(dá)水平的影響如圖4所示。與DSS組相比，DSS-FVP可抑制TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、MCP-1、MIP-1α和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的相對(duì)mRNA表達(dá)。此外，FVP處理后，caludin-1、ZO-1的mRNA相對(duì)表達(dá)增加（P<0.05）?？偟膩?lái)說(shuō)，FVP可以調(diào)節(jié)促炎細(xì)胞因子和緊密連接蛋白的mRNA表達(dá)，減少UC引起的mRNA表達(dá)的變化。

FVP改變了盲腸內(nèi)容物中SCFAs的濃度

盲腸內(nèi)容物中乙酸，丙酸，異丁酸，正丁酸，異戊酸，正戊酸和總酸的濃度如圖5A所示。DSS組的總酸濃度較低（P＜0.05）。經(jīng)FVP處理后，DSS-FVP組總酸、乙酸、丙酸和正丁酸濃度均升高（P＜0.05）。在糞便樣本中也有類(lèi)似的趨勢(shì)（圖5B）。說(shuō)明FVP能增加盲腸內(nèi)容物和糞便中SCFA的含量。

FVP和DSS改變小鼠腸道微生物多樣性

小鼠腸道微生物多樣性分析見(jiàn)圖6。這4組之間的香農(nóng)和辛普森指數(shù)如圖6A和B所示,與SD組相比，DSS組的Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)均較低（P＜0.05），說(shuō)明UC引起的微生物群落多樣性較低，但經(jīng)FVP處理后，DSS-FVP組微生物群落多樣性有所提高，正如我們預(yù)期的那樣，FVP可以促進(jìn)UC小鼠體內(nèi)微生物群落的多樣性。PCA和PCoA如圖6C和D所示，DSS組在X軸上與SD組和SD-FVP組完全分離（PCA為24.786%，PCoA為27.55%），經(jīng)FVP處理后，DSS-FVP組與SD組在X軸（PCA和PCoA）的距離均較DSS組近，結(jié)果表明，經(jīng)FVP處理后，DSS引起的腸道菌群變化得到緩解。樣本聚類(lèi)樹(shù)如圖6E所示，顯示DSS和DSS-FVP組、SD和SD-FVP組的腸道菌群組成相似，而DSS-FVP組比DSS組更接近SD-FVP和SD組。維恩圖如圖6F所示，四組小鼠共有408種腸道微生物，經(jīng)DSS和FVP處理后，DSS組有10種獨(dú)特的腸道微生物，DSS-FVP組有9種獨(dú)特的腸道微生物，SD-FVP組有35種獨(dú)特的腸道微生物，說(shuō)明各組之間的相似性和差異性。

FVP和DSS改變了小鼠腸道微生物的豐度

門(mén)水平小鼠腸道微生物的變化如圖7所示，每個(gè)樣品主要由Bacteroidetes、Firmicutes、Verrucomicrobia、Proteobacteria、Actinobacteria組成。圖7 A1顯示了糞便微生物群落的絕對(duì)豐度，顯示了每克糞便樣品中腸道微生物的細(xì)胞總數(shù)和每個(gè)門(mén)的腸道微生物細(xì)胞數(shù)。圖7 A2顯示了每個(gè)門(mén)的相對(duì)豐度，代表了每個(gè)門(mén)中腸道微生物的比例。DSS處理后Bacteroidetes數(shù)量減少（P＜0.05），FVP灌胃后Bacteroidetes數(shù)量增加到接近SD組和SD-FVP組的水平（P＜0.05）（圖7B）。相反，Firmicutes在DSS處理后顯著增加，而在FVP灌胃處理后減少（圖7c）。Verrucomicrobia, Proteobacteria、Actinobacteria的豐度在圖7A1和A2中是浮動(dòng)的。此外，圖7E所示的Firmicutes / Bacteroidetes比率代表了不同處理組之間的差異。

科水平的相對(duì)豐度存在差異，包括Porphyromonadaceae, Erysipelotrichaceae, Verrucomicrobiaceae, Lachnospiraceae, Lactobacillaceae, Bacteroidaceae, Ruminococcaceae, Rikenellaceae（圖8）。Porphyromonadaceae的相對(duì)豐度在DSS組呈下降趨勢(shì)，但經(jīng)FVP處理后增加。Lachnospiraceae的趨勢(shì)與之相反。四組間乳酸菌相對(duì)豐度無(wú)顯著性差異，但從絕對(duì)定量測(cè)序結(jié)果來(lái)看，DSS組Lactobacillus的絕對(duì)豐度實(shí)際上有所下降。

圖9為UC相關(guān)癥狀、相關(guān)基因表達(dá)與腸道微生物相關(guān)性分析的進(jìn)一步研究。共選取11種菌種進(jìn)行相關(guān)分析，測(cè)序結(jié)果表明，這11種菌種的相對(duì)豐度變化趨勢(shì)相同：即DSS處理與SD組相比，相對(duì)豐度發(fā)生變化（增加或減少），而DSS-FVP組經(jīng)FVP處理后得到恢復(fù)，指的是差異的減少或消失，說(shuō)明經(jīng)FVP灌胃后，UC引起的腸道菌群失調(diào)得到緩解或消除。這11種腸道微生物與腸道炎癥癥狀及相關(guān)基因表達(dá)呈顯著或極顯著相關(guān)。

PICRUSt預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)FVP和DSS改變了微生物群落功能

根據(jù)腸道菌群的變化，PICRUSt預(yù)測(cè)了DSS和FVP引起的功能變化，如圖10所示。DSS組與SD組比較，15個(gè)（9個(gè)富集，6個(gè)減少）功能模塊發(fā)生改變（P<0.05）。經(jīng)FVP處理后，DSS-FVP組8個(gè)功能模塊富集，主要引起一些代謝途徑的改變，如次生代謝物的生物合成、轉(zhuǎn)運(yùn)和分解代謝；細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)；輔酶和脂質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝。與DSS組相比，DSS-FVP組細(xì)胞骨架、細(xì)胞壁、膜和包膜生物發(fā)生相關(guān)的功能模塊也較DSS組得到富集（P<0.05）。

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