天昊生物功能微生物項(xiàng)目新文：尸體腐爛會(huì)增加氮污染并改變飲用水和黃河水中nirK反硝化菌群落的演替

發(fā)稿時(shí)間：2020-09-11來源：天昊生物

英文題目： Corpse decomposition increases nitrogen pollution and alters the succession of nirK-type denitrifying communities in different water types

中文題目：尸體腐爛會(huì)增加氮污染并改變飲用水和黃河水中nirK反硝化菌群落的演替

期刊名：Science of the Total Environment

影響因子：6.551

尸體分解作為一種高質(zhì)量的營養(yǎng)物質(zhì)輸入，會(huì)對(duì)水體環(huán)境產(chǎn)生強(qiáng)烈的擾動(dòng)，如導(dǎo)致高氮或高硝酸鹽污染。反硝化細(xì)菌可以將硝酸鹽還原為氮?dú)?，從而減少氮污染，提高水生生態(tài)系統(tǒng)的自我凈化能力。然而，水體中的nirK反硝化菌群落對(duì)尸體分解的反應(yīng)仍然是未知的。因此，我們采用高通量測(cè)序和化學(xué)分析方法，研究了自來水和黃河水中nirK型反硝化菌群落及其相應(yīng)的對(duì)照組在兩個(gè)重要的魚尸體分解階段（即晚期漂浮腐爛和沉沒殘骸）中的演替。我們的數(shù)據(jù)顯示，實(shí)驗(yàn)組的NH₄⁺-N濃度比對(duì)照組增加了大約3-4倍，Proteobacteria是nirK反硝化菌群落的優(yōu)勢(shì)類群。尸體群中富含Brucella和Achromobacter等幾種潛在致病菌屬。值得注意的是，尸體分解會(huì)顯著改變nirK反硝化菌群落結(jié)構(gòu)。隨著演替的進(jìn)行，尸體群的群落結(jié)構(gòu)變得更加相似，表明群落組成在最后階段趨同。水體pH、氧化還原電位（ORP）和處理是影響群落結(jié)構(gòu)的三個(gè)重要因素。但是，水體類型并不是決定尸體相關(guān)nirK反硝化菌群落的主要驅(qū)動(dòng)因素。在反硝化菌群落中檢測(cè)到4個(gè)系統(tǒng)發(fā)育簇，但在尸體和對(duì)照組之間的分布有顯著差異。這些結(jié)果為深入了解動(dòng)物尸體分解過程中nirK反硝化功能菌群和潛在致病菌提供了深入的認(rèn)識(shí)，為環(huán)境評(píng)價(jià)和管理提供了有價(jià)值的參考。

實(shí)驗(yàn)程序和采樣：

實(shí)驗(yàn)于2018年7月進(jìn)行。首先，我們從蘭州黃河段和當(dāng)?shù)氐膶?shí)驗(yàn)室水龍頭采集足夠的水到干凈的塑料桶中。從當(dāng)?shù)佤~類批發(fā)市場(chǎng)購買紅錦鯉20條（體重78.52±0.95g），作為分解動(dòng)物模型。所有魚均采用過量麻醉處死，然后將其隨機(jī)置于預(yù)先裝滿800ml水的塑料盒（20cm×18cm×15cm）中。將10個(gè)魚尸體分別放置在10個(gè)裝有自來水的盒子中，十個(gè)沒有任何尸體的裝有自來水盒子作為對(duì)照。同樣，剩余的魚尸體（n=10）被放置在盛產(chǎn)黃河水的盒子中，十個(gè)沒有任何尸體的裝有黃河水盒子作為對(duì)照。上述四組分別命名為TF（有尸體的自來水）、T（無尸體的自來水）、YF（有尸體的黃河水）和Y（沒有尸體的黃河水）。對(duì)魚尸體的觀察是在降解過程中開始的，我們收集了最后兩個(gè)階段的水樣：晚期漂浮腐爛（第15天）和沉沒殘?。ǖ?/span>19天）階段。每組有5個(gè)重復(fù)。從盒子中采集250 ml自來水，然后使用0.22μm纖維素膜過濾；用0.45μm濾膜過濾250ml黃河水，然后用0.22μm濾膜再次過濾。在提取DNA之前，將每個(gè)樣品的相應(yīng)濾膜及時(shí)保存在?20°C下。此外，還收集了額外的水樣（約100-150 ml），用于測(cè)量以下理化性質(zhì)。

理化性質(zhì)分析：

對(duì)每個(gè)水樣品的理化參數(shù)進(jìn)行分析，包括pH值、氧化還原電位（ORP）、電導(dǎo)率（CON）、氨態(tài)氮（NH₄⁺-N）、總?cè)芙夤腆w（TDS）、鹽度（Salinity）和總有機(jī)碳（TOC）。

二代測(cè)序：

使用濾膜提取基因組DNA，然后進(jìn)行nirK功能基因擴(kuò)增子測(cè)序（583F/909R）。

尸體降解過程中環(huán)境因子的變化

幾乎所有的環(huán)境因素都受到尸體的影響。例如，尸體組的平均pH值在7.16至8.40之間，并且無論水體類型或時(shí)間點(diǎn)，始終顯著低于對(duì)照組（均p<0.05）。對(duì)照組的氨態(tài)氮（NH₄⁺-N）值在5.12～15.12之間，而在尸體組氨態(tài)氮（NH₄⁺-N）從16.83變?yōu)?/span>41.06，因此在魚腐爛過程中氨態(tài)氮增加了大約3～4倍。相對(duì)于對(duì)照，尸體組的鹽度和總?cè)芙夤腆w（TDS）分別增加了約100倍和10倍。相對(duì)于對(duì)照，尸體組的ORP也顯著增加。而總有機(jī)碳（TOC）在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間幾乎沒有變化，除了Y和YF組。另外，兩個(gè)尸體組在各時(shí)間點(diǎn)的水質(zhì)理化因子，如NH₄⁺-N、pH、ORP、CON、TDS、鹽度等均無顯著性差異，說明兩組尸體雖然水體類型不同，但環(huán)境條件相似。在尸體降解過程中，實(shí)驗(yàn)組NH₄⁺-N、pH和TOC在第15-19天呈上升趨勢(shì)，而ORP、CON、TDS和鹽度則呈相反趨勢(shì)。

測(cè)序結(jié)果

本研究共收集40份樣本進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增，但有3份未能成功擴(kuò)增，從37個(gè)水樣中共獲得3226302條序列，質(zhì)量調(diào)整后，共獲得1769047條序列（每個(gè)樣本平均47812條序列）。用Framebot 進(jìn)行移碼矯正后，去除嵌合體、singletons和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后，每個(gè)樣本精簡(jiǎn)到3282條序列，并根據(jù)97%的核苷酸相似度將所有序列聚類為543個(gè)OTUs。OTU水平上，樣本的Goods coverage（平均值±SE）為99.10%±0.05%，說明測(cè)序數(shù)據(jù)覆蓋了大部分水體反硝化菌群落多樣性。此外，稀釋性曲線趨于平坦，表明測(cè)序結(jié)果反映了絕大多數(shù)的群落信息。

對(duì)照組與魚尸組nirK反硝化菌群落α多樣性的差異

對(duì)于α多樣性，ANOVA分析顯示尸體分解對(duì)nirK反硝化菌群落的α多樣性值無顯著影響，只有水體類型對(duì)Shannon，Simpson，Chao I和observed OTUs有顯著影響。此外，Mann-Whitney U檢驗(yàn)檢驗(yàn)顯示Shannon，Simpson，Chao I和observed OTUs等指數(shù)在對(duì)照組和尸體組也沒有表現(xiàn)出顯著差異（圖1）。此外，環(huán)境因素與α多樣性之間沒有顯著相關(guān)性。

尸體分解過程中不同組間nirK反硝化菌群落β多樣性比較

使用NMDS分析在尸體分解的兩個(gè)階段（晚期漂浮腐爛和沉沒殘?。S河水和自來水中nirK反硝化菌群落成員關(guān)系（基于Jaccard 距離）和結(jié)構(gòu)（基于Bray-Curtis具體）上的差異（圖2）。首先，除5T和5TF外，nirK反硝化菌群落的群落成員組成和結(jié)構(gòu)與對(duì)照組相比有顯著差異；PERMANOVA和ANOSIM分析（表1）進(jìn)一步證明了這些差異，表明尸體分解顯著改變了水中反硝化菌群落的群落成員和結(jié)構(gòu)。第二，4TF（第15天有魚尸體的自來水）和4YF（第15天有魚尸體的黃河水）之間存在微弱差異，而5TF（第19天有魚尸體的自來水）和5YF（第19天有魚尸體的黃河水）之間沒有顯著差異，這表明盡管不同的水類型，尸體降解過程使nirK反硝化菌群落的成員組成和結(jié)構(gòu)更加相似，PERMANOVA和ANOSIM分析也證實(shí)了這一結(jié)果。最后，4TF與5TF以及4YF和5YF無顯著性差異，說明同一類型水體的反硝化菌群落在不同階段間無顯著差異。

尸體分解過程中水體中nirK反硝化菌群落的組成

在門水平上，水體中nirK反硝化菌群落主要由Proteobacteria組成（平均相對(duì)豐度為81.73%），其次為未分類細(xì)菌（18.27%）（圖3）。為評(píng)估尸體分解過程中Proteobacteria豐度的變化，采用單向方差分析比較不同組間Proteobacteria平均相對(duì)豐度的變化，值得注意的是，黃河水體組Proteobacteria的平均相對(duì)豐度在漂浮腐爛晚期和沉沒殘骸期在尸體組顯著高于對(duì)照組，而自來水中Proteobacteria的平均相對(duì)豐度僅在漂浮腐朽晚期（第15天）在尸體組略有增加。

在屬水平上，nirK反硝化菌群落以Sinorhizobium (47.43%)、Pseudomonas (9.52%)、Achromobacter (3.75%)、Ensifer (3.09%)、Agrobacterium (2.16%) 、 Brucella (2.02%)為主。其他稀有屬（平均相對(duì)豐度<1%）包括Rhizobium、Mesorhizobium、Bradyrhizobium、Rhodopseudomonas、Starkeya、Alcaligenes、Ochrobactrum、Chelativorans、Pusillimonas、Roseobacter（圖4）。為了確定在尸體腐爛過程中發(fā)生顯著變化的屬，還使用了單向方差分析來比較不同組之間屬的平均相對(duì)豐度的變化。自來水中，從對(duì)照組到尸體組，Sinorhizobium的平均相對(duì)豐度顯著增加，而Rhodopseudomonas在第15天顯著減少，而在第19天TF組Bradyrhizobium明顯減少。在黃河水中，Mesorhizobium的平均相對(duì)豐度在第15天從對(duì)照組到尸體組均無明顯下降，第19天，YF組的Brucella數(shù)量顯著增加。

LEfSe分析也用于區(qū)分自來水和黃河水中尸體組和對(duì)照組之間的豐富類群（圖5），在自來水和黃河樣品中分別檢測(cè)到17個(gè)和11個(gè)生物標(biāo)志物，LDA值均超過3.6。在自來水中，TF組中差異豐度最高的細(xì)菌有lcaligenaceae、Burkholderiales、Betaproteobacteria、 Achromobacter、Brucellaceae、Brucella、 Ochrobactrum，而對(duì)照組T中差異最豐富的成員是Ensifer、Rhizobiaceae、Rhizobiales、Alphaproteobacteria（圖5a）。在黃河水中，LEfSe分析鑒定出Brucella、Brucellaceae、Agrobacterium、Alcaligenes在尸體組YF中富集，而對(duì)照組Y的生物標(biāo)志物則是Alphaproteobacteria 和Rhizobiales（圖5b）。

魚腐爛條件下環(huán)境參數(shù)對(duì)nirK反硝化菌群落的影響

環(huán)境因子與前10個(gè)屬的相關(guān)性如圖6所示。在屬水平上，Spearman相關(guān)分析表明，pH值與Sinorhizobium（r=-0.571，p<0.01）、Achromobacter (r = ?0.715, p < 0.05)、 Brucella (r = ?0.647, p < 0.01)、Rhizobium (r = ?0.421, p < 0.01) 、 Mesorhizobium (r=?0.473, p < 0.01)呈顯著負(fù)相關(guān)，pH值與Bradyrhizobium（r=0.570，p<0.01）和Rhodopseudomonas（r=0.493，p<0.01）呈正相關(guān)。RDA進(jìn)一步表明，pH值與不同屬間有很強(qiáng)的相關(guān)性。NH₄⁺-N和ORP與菌屬間的相關(guān)性與pH值相反，NH₄⁺-N與Sinorhizobium(r=0.330,p<0.05)、Pseudomonas(r=0.367,p<0.05)、Achromobacter (r = 0.720, p < 0.01)、 Brucella (r = 0.517, p < 0.01)呈正相關(guān)；與Bradyrhizobium (r = ?0.605, p < 0.01) and Rhodopseudomonas (r = ?0.488, p < 0.01) 呈負(fù)相關(guān)。

為了探討環(huán)境因素對(duì)nirK反硝化群落成員組成和結(jié)構(gòu)的影響，mantel檢驗(yàn)表明，在Jaccard和Bray-Curtis距離上，pH是影響nirK反硝化群落的最顯著因素，其次是ORP、處理、NH₄⁺-N、TDS、鹽度、水類型和CON（表2）。

與尸體降解相關(guān)的核心反硝化細(xì)菌

與尸體降解相關(guān)的核心反硝化微生物根據(jù)所有尸體樣本中至少80%的樣本中出現(xiàn)的OTUs來確定。核心微生物（31個(gè)OTU）占nirK反硝化群落的78.23%相對(duì)豐度（圖7a）。核心OTUs成員中大部分（45.26%）屬于Pseudomonas，第二優(yōu)勢(shì)成員隸屬于Rhizobiaceae（UG），占所有核心OTU的14%（圖7b）。OTU4_s_Achromobacter xylosoxidans與pH、NH ₄⁺ -N呈正相關(guān)，與ORP呈負(fù)相關(guān)（圖7c）。

nirK反硝化群落的系統(tǒng)發(fā)育聚類分析

nirK反硝化核苷酸的系統(tǒng)發(fā)育鄰域連接分析表明，65個(gè)優(yōu)勢(shì)OTU（平均相對(duì)豐度>0.1%）分為四個(gè)聚類（圖8）：聚類1以Sinorhizobium（14個(gè)OTU）為主，聚類2以Pseudomonas（9個(gè)OTU）為主，聚類3個(gè)以Ensifer（1個(gè)OTU）為主，聚類4以未分類細(xì)菌（18個(gè)OTU）為主。在聚類1中，尸體組的OTUs相對(duì)豐度顯著高于對(duì)照組，而聚類4在對(duì)照組中顯著高于尸體組。

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