【昊文章】鄭樹森院士團(tuán)隊(duì)MC發(fā)文ALKBH5介導(dǎo)m6A影響肝癌進(jìn)展

發(fā)稿時間：2020-09-03來源：天昊生物

近日，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院肝膽胰外科鄭樹森院士團(tuán)隊(duì)在Molecular Cancer雜志（IF=15.302）發(fā)表最新研究成果：去甲基化酶ALKBH5通過m6A修飾表觀上抑制下游靶點(diǎn)LYPD1從而限制了肝細(xì)胞癌的惡性。這一發(fā)現(xiàn)突出了m6A去甲基化酶的重要價值，豐富了對m6A表觀修飾在癌癥研究中的理解，進(jìn)一步為開發(fā)有效的預(yù)測因子和HCC治療策略提供了新的見解。其中，陳云浩博士作為論文的第一作者，鄭樹森院士和吳健教授作為論文的共同通訊作者(https://doi.org/10.1186/s12943-020-01239-w)。天昊生物有幸參與了論文的甲基化RNA免疫沉淀測序（MeRIP-seq）和數(shù)據(jù)分析工作。

m6A修飾作為一種新興的表觀遺傳調(diào)控，廣泛參與肝細(xì)胞癌(HCC)的腫瘤發(fā)生過程，為研究該疾病的分子發(fā)病機(jī)制提供了新的視角。多個m6A甲基化酶或去甲基化酶在HCC中已經(jīng)有相關(guān)報道參與腫瘤進(jìn)展，如METTL3、METTL14、WTAP、KIAA1429、FTO。然而m6A去甲基化酶之一AlkB同源物5 (ALKBH5)在HCC中的作用尚未得到充分證實(shí)。因此，課題組在這項(xiàng)研究力圖闡明ALKBH5在HCC中的生物學(xué)特性和潛在機(jī)制?，F(xiàn)將主要研究結(jié)果呈現(xiàn)給大家：

一、ALKBH5的表達(dá)下調(diào)與HCC患者不良預(yù)后相關(guān)

為了研究ALKBH5在HCC中的表達(dá)，作者首先分析了ALKBH5在HCC及相應(yīng)癌旁組織中的mRNA和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)ALKBH5在HCC中顯著下調(diào)(圖1a-c)。隨后，來自一個獨(dú)立HCC隊(duì)列的免疫組化證實(shí)了這些結(jié)果(圖1d, e)。此外，較低ALKBH5表達(dá)的HCC患者其總生存期(OS)和無復(fù)發(fā)生存期(RFS)更短(圖1f)。另外，ALKBH5的缺失可以作為HCC患者的獨(dú)立預(yù)后因素(HR = 2.24, P = 0.007)(圖1g)。這些結(jié)果提示ALKBH5的失調(diào)可能參與了HCC的進(jìn)展。

二、ALKBH5在體外和體內(nèi)抑制HCC增殖

為了評估ALKBH5在HCC中的生物學(xué)功能，首先在細(xì)胞系中利用CCK-8和菌落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)敲低ALKBH5可增強(qiáng)HCC細(xì)胞的增殖能力，而上調(diào)ALKBH5則表現(xiàn)出相反的效果(圖2a)。同樣，體外EdU檢測也顯示ALKBH5可以抑制細(xì)胞生長(圖2b-e)。其次，在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)當(dāng)ALKBH5沉默時，與對照組相比，移植瘤體積和重量均增加(圖2f)。相反，過表達(dá)ALKBH5會限制腫瘤生長，顯著降低腫瘤體積和重量(圖2g)。這些結(jié)果表明ALKBH5在體內(nèi)外均能抑制HCC腫瘤生長。

三、ALKBH5抑制HCC細(xì)胞的遷移/侵襲能力，并抑制體內(nèi)轉(zhuǎn)移

研究人員利用transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)抑制ALKBH5促進(jìn)了HCC細(xì)胞的遷移和侵襲能力，而過表達(dá)ALKBH5則影響了這些表型(圖3a)。傷口愈合實(shí)驗(yàn)也顯示，ALKBH5有減弱HCC細(xì)胞遷移的趨勢(圖3b)。有趣的是，當(dāng)ALKBH5沉默時，研究人員總能在顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)的改變。為了驗(yàn)證這種現(xiàn)象是否由細(xì)胞骨架重塑引起，隨后進(jìn)行了鬼筆環(huán)肽(phalloidin)染色。正如預(yù)期的一樣，通過微管和微絲的重排，ALKBH5的敲低導(dǎo)致細(xì)胞骨架更加松散和分散(圖3c, d)，這表明一種更加活躍的遷移形式。為了闡明ALKBH5在體內(nèi)對HCC轉(zhuǎn)移的影響，將ALKBH5過表達(dá)和陰性對照HCCLM3-luc細(xì)胞經(jīng)尾靜脈注射植入BALB/c小鼠體內(nèi)，并進(jìn)行生物發(fā)光成像。結(jié)果發(fā)現(xiàn)激活ALKBH5可以降低HCC細(xì)胞的轉(zhuǎn)移潛能，具有更低的熒光素酶活性及更少的肺轉(zhuǎn)移灶(圖3e, f)， HE染色結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)(圖3g)。相反，沉默ALKBH5則促進(jìn)了HCC的轉(zhuǎn)移。因此，ALKBH5在體外抑制了HCC細(xì)胞的遷移/侵襲能力，在體內(nèi)抑制了轉(zhuǎn)移能力。

四、MeRIP-seq結(jié)合RNA-seq結(jié)果顯示LYPD1是ALKBH5的靶點(diǎn)

作者首先應(yīng)用dot blot檢測了ALKBH5對m6A修飾的調(diào)節(jié)作用。ALKBH5的缺失導(dǎo)致Huh7和MHCC97H細(xì)胞中m6A水平明顯升高，而過表達(dá)ALKBH5則產(chǎn)生相反的結(jié)果(圖4a)。為了發(fā)現(xiàn)觀察到的依賴ALKBH5表型的確切機(jī)制，作者利用穩(wěn)定的ALKBH5過表達(dá)和載體轉(zhuǎn)染的HCCLM3細(xì)胞（每組兩個生物學(xué)重復(fù)），采用MeRIP-seq和RNA-seq相結(jié)合的方法（天昊生物參與部分實(shí)驗(yàn)和分析工作）。MeRIP-seq顯示，當(dāng)ALKBH5上調(diào)時，有1538個差異的m6A peaks豐度降低(1344個相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄本)。同時，RNA-seq發(fā)現(xiàn)了481個在ALKBH5過表達(dá)時下調(diào)的轉(zhuǎn)錄本。作者更重視甲基化模式和表達(dá)水平受ALKBH5調(diào)控的癌基因。因此只選擇那些在ALKBH5過表達(dá)時同時具有低的m6A peaks和表達(dá)降低的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行后續(xù)研究(圖4b)。為了進(jìn)一步縮小候選基因的范圍，集中在重疊的前10個基因，即COCH、LYPD1、ADAMTS14、ABCA4、TP53I11、COLCA2、TMED7、CYP4F3、IL17RB和VCAN。在ALKBH5沉默或過表達(dá)的細(xì)胞中通過qPCR進(jìn)行初步驗(yàn)證(圖4c)。有趣的是，在所有三種肝癌細(xì)胞中，只有LYPD1始終被ALKBH5負(fù)向調(diào)控(圖4d-g)，western blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了這一點(diǎn)(圖4h)。綜上所述，LYPD1可能是ALKBH5的直接下游靶點(diǎn)。

五、ALKBH5依賴于IGF2BP1介導(dǎo)m6A修飾破壞了LYPD1的穩(wěn)定性

MeRIP-seq分析顯示，隨著ALKBH5的過表達(dá)，LYPD1的3’UTR區(qū)m6A peak顯著縮小(圖5a)。為了證實(shí)這一結(jié)果，首先在Huh7和HCCLM3細(xì)胞中使用anti-ALKBH5抗體進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)。結(jié)果觀察到，ALKBH5可以富集LYPD1 mRNA(圖5b)，這意味著LYPD1可能在與ALKBH5相互作用后在RNA水平上受到調(diào)控。然后，利用針對潛在m6A位點(diǎn)的設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行MeRIP-qPCR檢測，結(jié)果顯示，敲低ALKBH5可促進(jìn)LYPD1 3’UTR區(qū)修飾，而激活ALKBH5可導(dǎo)致該位點(diǎn)m6A水平下降(圖5c)。為了進(jìn)一步證明m6A在調(diào)控LYPD1中的重要作用，研究人員設(shè)計(jì)了一個熒光素酶報告基因，插入一個野生型(WT) LYPD1 3’UTR序列或突變體(Mut)，其對應(yīng)的m6A位點(diǎn)發(fā)生了突變(圖5d)。與預(yù)期的一樣，當(dāng)ALKBH5沉默時，轉(zhuǎn)染LYPD1-WT質(zhì)粒的細(xì)胞熒光素酶活性呈上升趨勢，而突變組的熒光素酶活性似乎未受影響。類似的結(jié)果也可以在ALKBH5過表達(dá)的細(xì)胞中得到驗(yàn)證(圖5e)。此外，研究發(fā)現(xiàn)ALKBH5缺乏導(dǎo)致LYPD1 mRNA降解速度減慢，而ALKBH5過表達(dá)則破壞了LYPD1的穩(wěn)定性(圖5f)。

已經(jīng)明確了閱讀器(readers)對m6A修飾的轉(zhuǎn)錄本的直接影響至關(guān)重要，作者進(jìn)一步研究了參與上述過程的潛在效應(yīng)物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)YTHDF1/2和IGF2BP2/3的干預(yù)對LYPD1的表達(dá)幾乎沒有影響。然而，當(dāng)IGF2BP1受損時，LYPD1明顯受到抑制(圖5g)，這與IGF2BP1促進(jìn)其靶點(diǎn)轉(zhuǎn)錄的認(rèn)識是一致的。RIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)了IGF2BP1蛋白與LYPD1 mRNA的相互作用(圖5h)。此外，IGF2BP1敲低抑制了ALKBH5缺失引起的LYPD1積累(圖5i)。綜上所述，LYPD1受ALKBH5介導(dǎo)的m6A修飾調(diào)控，并被IGF2BP1識別從而增強(qiáng)了其穩(wěn)定性。

六、LYPD1被確認(rèn)為HCC的致癌驅(qū)動基因

為了闡明LYPD1在HCC中的作用，研究人員建立了LYPD1敲低的Huh7和MHCC97H細(xì)胞系(圖6a, b)。CCK-8和菌落形成試驗(yàn)表明，沉默LYPD1抑制細(xì)胞生長和生存能力(圖6a, b)，這一結(jié)果與EdU結(jié)果一致(圖6c, d)。此外，LYPD1缺失導(dǎo)致HCC細(xì)胞遷移和入侵能力的抑制(圖6e, f)。為了評估LYPD1在體內(nèi)的作用，慢病毒攜帶shRNA靶向LYPD1轉(zhuǎn)染到Huh7和MHCC97H細(xì)胞，隨后在裸鼠身上進(jìn)行了皮下植入實(shí)驗(yàn)。正如預(yù)期的那樣，LYPD1基因敲低顯著影響了移植瘤的生長(圖6g, h)。

此外，作者進(jìn)行了生物信息學(xué)分析以探討LYPD1的臨床相關(guān)性。TCGA的HCC隊(duì)列和GEO數(shù)據(jù)集的其他三個隊(duì)列的分析表明，與正常組織相比，腫瘤組織中LYPD1表達(dá)上調(diào)(圖6i)此外，Kaplan-Meier分析提示在HCC中LYPD1高表達(dá)與較差的OS和DFS相關(guān)(圖6j)。綜上所述，LYPD1在HCC發(fā)展過程中被激活，并促進(jìn)了HCC的腫瘤發(fā)生。

七、ALKBH5的抑制作用被LYPD1的缺失所逆轉(zhuǎn)

為了證實(shí)觀察到的表型是由ALKBH5-LYPD1信號軸的失調(diào)介導(dǎo)的，研究人員進(jìn)行了多次功能拯救實(shí)驗(yàn)。CCK-8和菌落分析顯示，ALKBH5的表達(dá)降低導(dǎo)致兩種HCC細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)，而這種能力可以通過沉默LYPD1逆轉(zhuǎn)(圖7a-d)。LYPD1的敲低也顯著地消除了ALKBH5缺失所導(dǎo)致的遷移能力增加(圖7e-g)。此外，傷口愈合實(shí)驗(yàn)表明，抑制ALKBH5不能促進(jìn)LYPD1沉默的Huh7和MHCC97H細(xì)胞的遷移(圖7h)。綜上所述，LYPD1功能障礙可能與ALKBH5介導(dǎo)的HCC細(xì)胞增殖或遷移特征有關(guān)。

八、ALKBH5/LYPD1軸在HCC中的臨床意義

為了進(jìn)一步探討HCC組織中ALKBH5和LYPD1表達(dá)的相關(guān)性，科研人員在第二個隊(duì)列的對這兩個蛋白進(jìn)行了IHC染色。正如所料，大約有62.2%的標(biāo)本的表達(dá)較低的ALKBH5但是呈現(xiàn)出強(qiáng)LYPD1染色，而近66.7%的ALKBH5高表達(dá)樣本表現(xiàn)出較弱的LYPD1染色(圖8a, b)。此外，兩個獨(dú)立的GEO數(shù)據(jù)的分析顯示，ALKBH5與LYPD1在RNA水平上呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)(圖8c)。綜上所述，在HCC樣本中，ALKBH5和LYPD1的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

天昊生物具有多年基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀組等多組學(xué)檢測與分析的經(jīng)驗(yàn)，m6A RNA甲基化作為表觀領(lǐng)域的一大熱點(diǎn)，天昊生物自主設(shè)計(jì)了m6A調(diào)控因子（writers/erasers/readers）差異表達(dá)分析檢測panel，還可以提供m6A修飾整體水平定量檢測，并結(jié)合MeRIP-seq和RNA-seq挖掘受m6A調(diào)控因子影響的下游靶點(diǎn)，同時可對相關(guān)的靶點(diǎn)進(jìn)行MeRIP-qPCR驗(yàn)證。生信團(tuán)隊(duì)亦可提供個性化的m6A數(shù)據(jù)庫挖掘與生信分析內(nèi)容。

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