01

原理：

◆首先利用細(xì)菌（16S）或真菌（ITS）的通用引物進(jìn)行qPCR，獲得樣本總細(xì)菌或總真菌的總拷貝數(shù)；

◆然后使用常規(guī)細(xì)菌16S相對定量擴(kuò)增子測序或者常規(guī)真菌ITS相對定量擴(kuò)增子測序獲得每個物種相對豐度（百分比）；

◆通過微生物總拷貝數(shù)和物種相對豐度的乘積來推斷每個微生物的絕對豐度。

優(yōu)點(diǎn)：

應(yīng)用比較靈活，對已有常規(guī)擴(kuò)增子測序結(jié)果的項(xiàng)目可以補(bǔ)加微生物總拷貝數(shù)qPCR檢測，從而轉(zhuǎn)化成絕對定量結(jié)果。

局限性：

◆微生物總拷貝數(shù)與各菌種相對豐度信息分別來源于qPCR和高通量測序兩個獨(dú)立檢測方法，兩種方法檢測都存在一定誤差，并且這種誤差無法得到矯正，從而使獲得的特定菌種拷貝數(shù)準(zhǔn)確性受到影響。

◆這種聯(lián)合只適合高豐度物種（物種的相對豐度大于10%）的絕對豐度推斷，當(dāng)物種的相對豐度較低時，這種聯(lián)合分析推斷的絕對豐度估計(jì)值很容易出錯，并且可能在從低細(xì)菌豐度增殖時期和后期收縮到低豐度的過程中可能會歪曲單個物種的動力學(xué)。

◆qPCR進(jìn)行微生物總拷貝數(shù)定量時，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品不含有腐殖酸而環(huán)境樣本則含有腐殖酸，并且兩者在兩個樣本孔中分別進(jìn)行各自的PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)效率不同，因此微生物總拷貝數(shù)qPCR定量結(jié)果會有偏差，從而對后續(xù)獲得的特定菌種拷貝數(shù)準(zhǔn)確性有影響。

相關(guān)文獻(xiàn)解讀：

相對豐度會歪曲實(shí)際豐度，聯(lián)合16S擴(kuò)增子測序和總菌qPCR獲得的絕對豐度可靠嗎？；

Atmospheric Environment：對真菌氣溶膠種群進(jìn)行相對豐度和絕對豐度比較研究；

02

原理：

◆首先利用流式細(xì)胞技術(shù)獲得樣本的總細(xì)胞數(shù)（單位為細(xì)胞數(shù)/μl水體、細(xì)胞數(shù)/ g糞便）；

◆然后使用常規(guī)相對定量擴(kuò)增子測序獲得每個物種相對豐度（百分比）；

◆通過總細(xì)胞數(shù)和物種相對豐度的乘積來推斷每個微生物的絕對豐度（單位為細(xì)胞數(shù)/μl水體、細(xì)胞數(shù)/ g糞便）。

糞便樣本流式細(xì)胞計(jì)數(shù)具體步驟：在生理溶液中將0.2 g樣品稀釋100000倍，為了去除糞便溶液中的碎屑，使用無菌注射器過濾器（孔徑5μm）對樣本進(jìn)行過濾；接下來用1μl SYBR Green I（在二甲基亞砜中稀釋1:100；在37°C下孵育15分鐘）對獲得的1 ml微生物細(xì)胞懸浮液進(jìn)行染色；用FL1 533/30 nm和FL3>670nm光學(xué)檢測器檢測熒光，前向和側(cè)向散射光也被收集，從而對懸浮液中存在的微生物細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行分析。

水體樣本流式細(xì)胞計(jì)數(shù)具體步驟：水體樣本在無菌0.22μm過濾瓶裝礦泉水中稀釋兩次，并在室溫下放置10分鐘；用SYBR Green I（10000倍濃縮液）染色，并在37°C下培養(yǎng)20分鐘（SYBR Green I最終濃度=1倍濃縮液）；在四個熒光檢測器（530/30 nm，585/40 nm，>670 nm，675/25 nm）和兩個散射檢測器（50μL/樣品固定體積模式）上通過流式細(xì)胞儀器進(jìn)行分析，以便準(zhǔn)確量化細(xì)胞數(shù)目。

優(yōu)點(diǎn)：

直接計(jì)數(shù)微生物的細(xì)胞數(shù)，不需要將16S基因拷貝數(shù)矯正成微生物細(xì)胞數(shù)

局限性：

◆流式細(xì)胞儀器較昂貴，流式細(xì)胞計(jì)數(shù)涉及樣本前處理、熒光染色和細(xì)胞計(jì)數(shù)過程，過程復(fù)雜，操作要求高；

◆需要根據(jù)不同類型樣本，優(yōu)化最佳的上樣濃度、染色劑濃度、孵育時間、上樣速度、讀取時間、儀器檢測參數(shù)，因此需要針對不同類型樣本優(yōu)化最佳檢測體系；

◆適合液態(tài)樣本檢測，像土壤糞便等樣本需要溶解稀釋并過濾去除雜質(zhì)才能上樣檢測。

相關(guān)文獻(xiàn)解讀：

Nature：要想真正研究宿主-腸道微生物的相互作用，必須將相對定量變成絕對定量；

The ISME Journal：為什么微生物相對定量不能代替絕對定量；

03

原理：

◆向樣本中直接加入一種已知拷貝數(shù)的外源自然界已知菌株或其DNA，混勻后，然后進(jìn)行常規(guī)擴(kuò)增子測序；

◆根據(jù)內(nèi)標(biāo)菌株已知的絕對數(shù)量，及通過擴(kuò)增子測序分析獲得內(nèi)標(biāo)菌株的相對豐度，可以計(jì)算出樣本原生微生物的總絕對豐度以及每個微生物的絕對豐度。

優(yōu)點(diǎn)：

◆不但可以進(jìn)行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析和環(huán)境因子分析等常規(guī)擴(kuò)增子測序分析；

◆還可以同時解析樣本中特定物種和總細(xì)菌的絕對拷貝數(shù)；

◆如果從樣本開始就加入內(nèi)標(biāo)菌株，就可以校正從抽提到測序整個流程的實(shí)驗(yàn)誤差。

局限性：

◆內(nèi)標(biāo)菌株是自然界已知存在的菌，內(nèi)標(biāo)菌株加入可能會影響樣本中原生此菌的定量；

◆只有單個標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)，沒有引入標(biāo)準(zhǔn)曲線，存在可靠性無法驗(yàn)證的問題

相關(guān)文獻(xiàn)：

Smet et al. A method for simultaneous measurement of soil bacterial abundances and community composition via 16S rRNA gene sequencing . Soil Biology & Biochemistry, 2016, 96, 145-151.

04

原理：

該方法通過向樣品DNA中添加梯度拷貝數(shù)的內(nèi)標(biāo)序列（內(nèi)標(biāo)序列為人工合成的16S rRNA基因部分序列，與自然界所有菌的對應(yīng)序列相比具有特異性），然后將混合樣本一起進(jìn)行PCR擴(kuò)增、文庫構(gòu)建、測序，再根據(jù)內(nèi)標(biāo)序列的16S擴(kuò)增子reads數(shù)及其絕對拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出樣品中OTUs代表序列對應(yīng)物種16S rRNA基因絕對拷貝數(shù)，然后天昊生物基于創(chuàng)新算法將OTUs水平的16S基因拷貝數(shù)矯正成物種水平的16S基因拷貝數(shù)，基于矯正過的16S基因拷貝數(shù)數(shù)據(jù)進(jìn)行后續(xù)的生信分析結(jié)果更加真實(shí)可靠。

優(yōu)點(diǎn)：

◆不但可以進(jìn)行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析和環(huán)境因子分析等常規(guī)擴(kuò)增子測序分析；

◆還可以同時解析樣本中特定物種和總細(xì)菌的絕對拷貝數(shù)；

◆進(jìn)行細(xì)菌拷貝數(shù)定量時，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)標(biāo)和樣本DNA是在同一個樣本孔中一起進(jìn)行PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)效率相同，因此校正了腐殖酸對PCR的影響，避免了腐殖酸等PCR抑制物對環(huán)境樣本（例如土壤，水體和淤泥）細(xì)菌16S拷貝數(shù)定量的影響，因此特別適合土壤和水體樣本的微生物絕對定量。

局限性：

◆測序數(shù)據(jù)量高于常規(guī)微生物16S擴(kuò)增子測序，成本有所增加；

◆實(shí)驗(yàn)所需的樣本DNA量高于相對定量擴(kuò)增子測序

相關(guān)文獻(xiàn)解讀：

喜訊！天昊生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序項(xiàng)目文章再次登陸《Science of the Total Environment》；

又一篇！天昊生物微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)再發(fā)好文；

祝賀！天昊生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)助力客戶登陸Science of the Total Environment；