【昊文章】天昊WES平臺(tái)助力客戶解析遺傳性小兒肝病與雙等位基因突變的復(fù)雜關(guān)聯(lián)

發(fā)稿時(shí)間：2020-08-06來(lái)源：天昊生物

2017年，天昊生物WES平臺(tái)，協(xié)助復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院肝病科王建設(shè)教授課題組，揭示了第一個(gè)由中國(guó)研究人員發(fā)現(xiàn)的膽汁淤積癥致病基因，并初步闡明了MYO5B缺陷導(dǎo)致膽汁淤積的臨床特點(diǎn)、在不明原因低GGT膽汁淤積癥中的比例、以及突變嚴(yán)重程度與不同表型的關(guān)系，為膽汁淤積癥的精確診斷向前推進(jìn)了一步（鏈接“工匠精神”不能停--2016天昊生物醫(yī)學(xué)基因組測(cè)序文章集錦）。

復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院肝病科王建設(shè)教授課題組簡(jiǎn)介：擅長(zhǎng)兒童黃疸和各種疑難肝臟病，包括遺傳代謝性、病毒性、自身免疫性、脂肪性肝病的診斷和治療。擔(dān)任中華醫(yī)學(xué)會(huì)感染病分會(huì)委員、全國(guó)小兒感染和肝病學(xué)組組長(zhǎng)、中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)感染病醫(yī)師分會(huì)委員等；擔(dān)任中華傳染病雜志、Bangladesh Liver Journal、中華臨床感染病雜志等雜志編委。主持多項(xiàng)國(guó)家自然科學(xué)基金、教育部引智項(xiàng)目等，參與國(guó)家重大科技專項(xiàng)和上海市重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目的研究工作。

下面小編就帶大家一起學(xué)習(xí)一下2篇文章，了解一下遺傳性小兒肝病與雙等位基因突變存在怎樣的復(fù)雜關(guān)聯(lián)。

英文題目：RINT1 Bi-allelic Variations Cause Infantile-Onset Recurrent Acute Liver Failure and Skeletal Abnormalities

中文題目：RINT1雙等位基因變異引起嬰兒期復(fù)發(fā)性急性肝功能衰竭和骨骼異常

發(fā)表信息：Am J Hum Genet (IF: 10.502). 2019 Jul 3;105(1):108-121. doi: 10.1016/j.ajhg.2019.05.011. Epub 2019 Jun 13.

背景：

• 嬰幼兒急性肝功能衰竭（ALF）是一種嚴(yán)重的、危及生命的疾病，有廣泛的發(fā)病原因，包括感染、毒素暴露、自身免疫性疾病、休克、遺傳性代謝性疾病和其他一些罕見(jiàn)的病因。復(fù)發(fā)性急性肝功能衰竭（RALF）描述了在嬰兒患者中出現(xiàn)的反復(fù)發(fā)作的嚴(yán)重?fù)p傷和肝功能的恢復(fù)。
• Haack等人報(bào)道了一系列NBAS基因（NBAS[MIM：608025]）的雙堿基變異導(dǎo)致RALF的個(gè)體。這種類型的肝衰竭疾病，在嬰兒期發(fā)病，由發(fā)熱性疾病誘發(fā)ALF，現(xiàn)在被稱為嬰兒肝衰竭綜合征，2型（MIM：616483）。
• 尚未有報(bào)道RINT1基因與任何人類疾病明確相關(guān)，且尚無(wú)報(bào)道發(fā)現(xiàn)RINT1的雙堿基致病變異。本研究描述了3名患有RALF和骨骼異常的兒童，通過(guò)WES發(fā)現(xiàn)3名患者均攜帶RINT1復(fù)合雜合性變異。研究者認(rèn)為RINT1的雙雜合致病變異導(dǎo)致了一種尚未被報(bào)道過(guò)的疾病，其特征是類似于NBAS功能缺失導(dǎo)致的RALF，但也有獨(dú)特的骨骼缺損表型，類似于溶酶體病。

研究方法：

1. 三個(gè)家系樣本全外顯子測(cè)序（箭頭指示樣本為進(jìn)行WES的樣本），下圖展示了家系圖和患者的RINT1的復(fù)合雜合突變來(lái)源情況（天昊生物完成部分患者的WES工作）。

2. 患兒均經(jīng)過(guò)完善的肝臟活檢和骨骼檢查。

3. 成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：從患者1和患者3的皮膚活檢組織培養(yǎng)獲得原代真皮成纖維細(xì)胞，同時(shí)也從一個(gè)無(wú)關(guān)遺傳病患者身上培養(yǎng)獲得真皮成纖維原代細(xì)胞，作為RNA轉(zhuǎn)錄組測(cè)序?qū)嶒?yàn)的對(duì)照。

4. 成纖維細(xì)胞中RINT1, NBAS和p31的蛋白 Western Blot檢測(cè)，以及40度高溫刺激18h后的蛋白水平檢測(cè)。

5. 成纖維細(xì)胞中的高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)高爾基中間室的免疫熒光檢測(cè)。

6. 自噬標(biāo)記物L(fēng)C3蛋白檢測(cè)。

7. 式細(xì)胞儀檢測(cè)：患者1來(lái)源的血液淋巴細(xì)胞進(jìn)行雙鏈斷裂DNA修復(fù)途徑基因的流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

結(jié)果：

1.臨床發(fā)現(xiàn)

肝臟活檢未能通過(guò)光學(xué)或電子顯微鏡顯示出任何特征性的異常（圖1），但注意到脂肪變性（患者1和患者2）和橋接性壞死（患者1）。Kupffer細(xì)胞輕度增加，表明肝細(xì)胞損傷和局灶性肝細(xì)胞膽汁淤積（患者3）。沒(méi)有發(fā)現(xiàn)超微結(jié)構(gòu)的變化，但在肝細(xì)胞中可以看到許多脂滴，高爾基體不能清晰可見(jiàn)；三患者都表現(xiàn)出椎體異常，包括前突和不規(guī)則，至少有一個(gè)低度發(fā)育的椎體。

2.全外顯子組測(cè)序確定RINT1中的雙等位基因變異

圖：WES在三個(gè)受影響的個(gè)體中的都發(fā)現(xiàn)了RINT1的復(fù)合雜合突變（圖1和圖2）。有趣的是，在每個(gè)患兒中都發(fā)現(xiàn)了一個(gè)同位置的單核苷酸變異，位于9號(hào)外顯子的剪切供體位點(diǎn)(c.1333+1G>A或c.1333+1G>T)，預(yù)計(jì)會(huì)影像外顯子9的供體剪切。其他錯(cuò)義或者缺失變異都影響蛋白質(zhì)中的保守殘基，并被預(yù)測(cè)為致病位點(diǎn)。

3.剪切位置的變異導(dǎo)致外顯子跳躍和無(wú)義介導(dǎo)的mRNA降解（NMD）基于患者1的成纖維細(xì)胞RNA的測(cè)序數(shù)據(jù)，我們觀察到3條read支持從外顯子8到外顯子10的接合和外顯子9的跳躍，40條read支持從外顯子8到9的常規(guī)接合，49條read支持從外顯子9到10的常規(guī)接合（圖3）。用嘌呤霉素處理細(xì)胞以阻斷蛋白翻譯和NMD， 增加了支持外顯子9跳躍的read數(shù)。我們觀察到31條read（23.0%）支持外顯子9的跳躍。

這些數(shù)據(jù)表明，c.1333+1處的剪接變異會(huì)導(dǎo)致第9外顯子的跳躍(殘基370-444的缺失)，以及導(dǎo)致第10外顯子移碼形成較早的終止密碼子，引發(fā)mRNA發(fā)生NMD。

4.蛋白功能檢測(cè)

基于成纖維細(xì)胞系的WB檢測(cè)，患者表現(xiàn)出低RINT1蛋白水平。40度高溫刺激后，蛋白水平表現(xiàn)進(jìn)一步下降，但是差異不顯著。ER-高爾基中間隔室（ERGIC53）的免疫熒光染色表明，患者表現(xiàn)為彌漫和擴(kuò)大的ERGIC、，這可能與囊泡在逆行囊泡運(yùn)輸中表現(xiàn)運(yùn)輸和對(duì)接至ER效率不足相一致。RINT1的缺失先前證明與條件KO小鼠神經(jīng)元的自噬缺陷相關(guān)。與這些數(shù)據(jù)一致，我們發(fā)現(xiàn)患者1和3的LS3顯著增加。LC3染色增加的情況并沒(méi)有因?yàn)樽允审w-溶酶體融合的抑制劑巴氏霉素A1的處理而進(jìn)一步加重，這說(shuō)明這些患者存在自噬體清除率的降低。

研究結(jié)論：

綜上所述，研究者描述了三個(gè)沒(méi)有血緣關(guān)系的兒童，他們都患有RALF和骨骼異常，外顯子組測(cè)序提示他們均攜帶RINT1的復(fù)合雜合性突變，導(dǎo)致RINT1水平不足、高爾基形態(tài)異常和自噬受損。研究者認(rèn)為RINT1雙等位基因的致病變異導(dǎo)致了一種以前未被認(rèn)識(shí)的疾病，這種疾病具有類似于NBAS缺失者的RALF特征。

英文題目：Low‐GGT intrahepatic cholestasis associated with biallelic USP53 variants: Clinical, histological and ultrastructural characterization

中文題目：與USP53雙堿基變異相關(guān)的低GGT肝內(nèi)膽汁淤積癥：臨床、組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)特征分析

發(fā)表信息：Liver Int (IF: 5.175). 2020 May;40(5):1142-1150. doi: 10.1111/liv.14422. Epub 2020 Apr 7.

背景：

• 約20%的正?；蜉^低的血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶（GGT）活性膽汁淤積癥患兒，尚未確定其病因。與該疾病易感或致病相關(guān)的基因包括ATP8B1、ABCB11、TJP2、NR1H4、MYO5B等。
• 2019年全外顯子組測(cè)序(WES)確定了與低GGT膽汁淤積癥有關(guān)的幾個(gè)基因，包括USP53。該基因編碼功能不確定的蛋白質(zhì)，與細(xì)胞緊密連接相關(guān)。該基因在一個(gè)膽汁淤積癥家族中發(fā)生突變，有聽(tīng)力損失表型。

研究方法：

對(duì)2011年-2018年納入的69名患有低GGT膽汁淤積癥的兒童進(jìn)行了全外顯子組測(cè)序，這些患兒均不攜帶ATP8B1、ABCB11、TJP2、NR1H4、MYO5B的致病突變。進(jìn)行患者臨床記錄，肝臟活檢材料的光學(xué)顯微鏡和透射電子顯微鏡檢查結(jié)果分析。采用天昊正常人群測(cè)序數(shù)據(jù)為健康對(duì)照數(shù)據(jù)。

結(jié)果：

1. 在符合我們標(biāo)準(zhǔn)的69例低GGT肝內(nèi)膽汁淤積癥小兒患者中，有來(lái)自7個(gè)不相關(guān)家系的7例患者攜帶同種或復(fù)合雜合形式的雙堿基USP53突變（圖1），與之相反的是“其他肝臟疾病”對(duì)照組（7/69 vs 0/84，P = .00319）和 "非肝病 "對(duì)照組中均沒(méi)有這些復(fù)合突變情況存在（7/69 vs 0/1000，P = 3.47e-9）。疾病符合常染色體隱性遺傳，患者也攜帶一些其它基因突變，但這些基因未有報(bào)道提示與肝有確定的關(guān)系。

2. 在7例患者中，共檢測(cè)到USP53基因的10個(gè)致病或疑似致病突變（2個(gè)已知，8個(gè)未知）。具體信息見(jiàn)下表：

3. 7位患者的臨床信息見(jiàn)下表

4. 組織病理學(xué)、免疫組織學(xué)和超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)
1）四個(gè)來(lái)源于患者的現(xiàn)有的肝臟樣本中都存在小葉紊亂和肝細(xì)胞膽汁淤積及糜爛，伴有管狀膽汁淤積。P3、P6和P7患者肝細(xì)胞的巨細(xì)胞變化可見(jiàn)，但P4未能觀察到。所有患者均有明顯的纖維化，P3患者為橋接區(qū)纖維化，P4為竇周和細(xì)胞周圍纖維化，伴有實(shí)質(zhì)結(jié)節(jié)；P6為肝硬化；P7為門脈纖維化和急性和慢性混合性炎癥。

2) USP53的免疫染色在技術(shù)上未能成功。然而，兩個(gè)緊密連接相關(guān)蛋白TJP2和CLDN1的表達(dá)水平和定位都出現(xiàn)了下降和定位模糊。在兩個(gè)USP53突變病患者中，有適合超微結(jié)構(gòu)研究的肝臟活檢材料（P3和P4）。結(jié)果顯示，相對(duì)于攜帶ATP8B1或ABCB11突變的患者，該研究中的病例緊密連接復(fù)合物被拉長(zhǎng)，從膽汁管壁邊緣延伸出來(lái)，深入細(xì)胞間空間深處。

5. 聽(tīng)力表型：患者P6在3歲42天時(shí)未能通過(guò)TEOAE聽(tīng)力篩查。在1歲時(shí)放置了人工耳蝸。患者P2通過(guò)了新生兒TEOAE篩查。然而，在1個(gè)月大時(shí)，注意到他對(duì)聲音沒(méi)有反應(yīng)。在4個(gè)月大的時(shí)候，他的右耳ABR結(jié)果略有異常（35dBnHL）。后來(lái)他開(kāi)始對(duì)環(huán)境聲音有反應(yīng)，16個(gè)月時(shí)ABR合格。其它所有其他患者都通過(guò)了新生兒TEOAE篩查，并有沒(méi)有顯示出聽(tīng)力問(wèn)題的跡象。

研究討論：

6. USP53突變患者的表型存在異質(zhì)性。

7. 不僅僅只與膽汁淤積相關(guān)，USP53雜合狀態(tài)下的突變可能會(huì)增加遺傳性肝病的發(fā)病率或嚴(yán)重性。

8. 研究不足：未能檢測(cè)USP53的免疫組化結(jié)果，部分患者病理組織缺失。

研究結(jié)論：

研究者鑒定了7名患者的USP53雙堿基變異，與低GGT膽汁淤積癥有關(guān)，加上光鏡檢查結(jié)果和肝臟活檢的超微結(jié)構(gòu)結(jié)果，擴(kuò)展了肝內(nèi)膽汁淤積癥相關(guān)USP53突變的初步報(bào)告。他們的觀察進(jìn)一步表明，USP53突變可能產(chǎn)生TJP2突變疾病的部分肝臟和耳朵相關(guān)表型。

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