代謝組入門一問一答（三）

發(fā)稿時(shí)間：2020-06-24來源：天昊生物

                                                          

Q1代謝組檢測報(bào)告中哪些部分對(duì)發(fā)表文章是比較重要的？

◆樣品制備描述：樣本提取過程和預(yù)處理（例如衍生化）過程描述

◆上機(jī)檢測描述：色譜柱和質(zhì)譜儀型號(hào)、色譜分離條件（流速、流動(dòng)相組成、進(jìn)樣量）、流動(dòng)相梯度洗脫程序、質(zhì)譜檢測參數(shù)

◆原始數(shù)據(jù)：獲取原始數(shù)據(jù)，例如總離子流色譜圖（TIC）、.CSV格式數(shù)據(jù)

◆數(shù)據(jù)預(yù)處理描述：基線矯正、去噪、峰對(duì)齊、峰識(shí)別、歸一化等數(shù)據(jù)預(yù)處理過程描述（包括軟件、數(shù)據(jù)庫）

◆優(yōu)化數(shù)據(jù)：經(jīng)過數(shù)據(jù)預(yù)處理獲得的可以用于后續(xù)生信分析的優(yōu)化數(shù)據(jù)

◆圖表描述：例如PCA、PLS-DA、OPLS-DA、差異代謝物鑒定、差異代謝物通路分析等生信分析流程描述（包括軟件、數(shù)據(jù)庫）

◆QC描述：描述QC樣本如何設(shè)置和體系穩(wěn)定性好壞結(jié)果評(píng)判

Q2代謝組常用的數(shù)據(jù)庫有哪些？
◆總的說來GC-MS有成熟的商業(yè)數(shù)據(jù)庫，例如NIST、GMD、FiehnLib數(shù)據(jù)庫，而LC-MS缺乏成熟的商業(yè)數(shù)據(jù)庫，一般參考HMDB、METLIN、MzCloud以及一些公司自建庫。

◆HMDB（http://www.hmdb.ca）：主要收錄人體內(nèi)源性代謝產(chǎn)物，是目前最完整的人類代謝物數(shù)據(jù)庫，主要適用于LC-MS。

◆METLIN（https://metlin.scripps.edu）：收錄了不同物種內(nèi)源性代謝物和外源性（例如藥物代謝）代謝物，主要特征是含有大量代謝物的二級(jí)質(zhì)譜圖（MS/MS），主要適用于LC-MS。

◆GMD (http://gmd.mpimp-golm.mpg.de/)：主要特點(diǎn)是收錄了大量植物代謝物的GC-MS圖譜，因此適用于GC-MS。

◆Lipid Maps（http://www.lipidmaps.org/data/structure/）：是目前最大的公共脂質(zhì)數(shù)據(jù)庫，因此適用于脂質(zhì)組學(xué)。

Q3非靶向代謝組學(xué)鑒定差異代謝物的基本流程是什么？

◆非靶向代謝組學(xué)鑒定代謝物的原則是先定量（基于峰面積）后定性（基于分子質(zhì)量和相關(guān)結(jié)構(gòu)信息），因此非靶向代謝組學(xué)鑒定差異代謝物的基本流程即一般通過單變量分析方法（t檢驗(yàn)的p值）和多變量分析方法（OPLS-DA模型的VIP值）比較不同組別中離子的相對(duì)強(qiáng)度，然后篩選出有顯著性差異的離子，然后結(jié)合這些差異離子的保留時(shí)間、質(zhì)荷比（m/z）、精確分子量、二級(jí)質(zhì)譜MS/MS碎片信息來進(jìn)行搜尋數(shù)據(jù)庫鑒定，從而得到組間有顯著差異的代謝物名稱，因此如果想得到全物質(zhì)（全譜）鑒定的信息需要提前和檢測單位溝通。

Q4一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜的區(qū)別是什么？
◆一級(jí)質(zhì)譜：檢測所有帶電離子的質(zhì)荷比和強(qiáng)度，形成一級(jí)質(zhì)譜圖，一級(jí)質(zhì)譜中的信號(hào)為母離子肽段信號(hào)。GC-MS一級(jí)質(zhì)譜可以進(jìn)行定性分析（因?yàn)镚C-MS有成熟的標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)庫，可直接將檢測到的物質(zhì)離子的譜圖數(shù)據(jù)與數(shù)據(jù)庫比對(duì)進(jìn)行定性），而LC-MS一級(jí)質(zhì)譜只能用于簡單的分子量測定（因?yàn)長C-MS沒有成熟的標(biāo)準(zhǔn)圖譜數(shù)據(jù)庫，需要結(jié)合二級(jí)質(zhì)譜MS/MS數(shù)據(jù)進(jìn)行定性）。

◆二級(jí)質(zhì)譜：通過對(duì)一級(jí)質(zhì)譜產(chǎn)生的母離子進(jìn)一步裂解，分析所形成的子離子碎片的質(zhì)荷比和強(qiáng)度。LC-MS/MS二級(jí)質(zhì)譜可以用于定性分析，可以對(duì)更多的物質(zhì)進(jìn)行準(zhǔn)確檢測。

Q5代謝組學(xué)如何選擇合適的掃描模式？
◆非靶向代謝組學(xué)：一般選擇Full scan全掃模式獲得一級(jí)質(zhì)譜信息，如果想同時(shí)獲得一級(jí)質(zhì)譜MS（每個(gè)峰代表母離子）和二級(jí)質(zhì)譜MS/MS（每個(gè)峰代表子離子）信息，需要用DDA和DIA掃描模式，DIA與DDA不同之處在于DIA模式不預(yù)先對(duì)母離子進(jìn)行篩選，即某個(gè)時(shí)間點(diǎn)的所有離子全部被打碎，因此DIA能獲取所有母離子的碎片信息，因此采集數(shù)據(jù)多，信息全。

◆靶向代謝組學(xué)：一般選擇多反應(yīng)離子檢測（MRM）掃描模式

Q6總離子流圖（TIC）每一個(gè)峰代表什么？
◆TIC圖可以想象成一個(gè)立體圖，色譜把物質(zhì)分開后，每種物質(zhì)依次進(jìn)入質(zhì)譜，所以在每一個(gè)保留時(shí)間（RT, retention time）上，每個(gè)峰是代表質(zhì)譜儀采集的某一大類物質(zhì)的所有不同質(zhì)荷比（m/z）的離子的總和。正常分離的情況下，每個(gè)峰代表一個(gè)物質(zhì)或一大類物質(zhì)。

Q7LC-MS和GC-MS的離子源有什么不同？
◆LC-MS使用的是電噴霧離子源（ESI）或大氣壓化學(xué)電離源（APCI），ESI應(yīng)用比APCI更為廣泛，適用分析離子型和極性物質(zhì)。

◆GC-MS使用的電子轟擊電離（EI）或正化學(xué)電離（CI）離子源，其中EI屬于硬電離，適用分析易揮發(fā)、分子量小的低極性物質(zhì)。

Q8LC-MS和GC-MS的數(shù)據(jù)呈現(xiàn)有什么不同？
◆LC-MS儀器在正離子模式和負(fù)離子模式下運(yùn)行，因此LC-MS數(shù)據(jù)可以分為正離子模式和負(fù)離子模式兩種數(shù)據(jù)，例如PCA、PLS-DA、OPLS-DA、差異代謝物等數(shù)據(jù)都分為正負(fù)離子兩種模式，差異代謝通路分析時(shí)則將正負(fù)離子模式找到的差異代謝通路合并在一起，兩種模式鑒定到的差異代謝通路有重疊時(shí)則選擇響應(yīng)強(qiáng)的。

◆GC-MS儀器只在一種模式下運(yùn)行，因此GC-MS數(shù)據(jù)不區(qū)分正負(fù)離子模式。

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