代謝組入門一問一答（二）

發(fā)稿時(shí)間：2020-06-22來源：天昊生物

Q1非靶向代謝組和靶向代謝組一般選用什么質(zhì)譜儀器？

質(zhì)譜儀以離子源、質(zhì)量分析器和離子檢測器為核心，離子源是使分子在高真空條件下離子化的裝置，電離后的分子因接受了過多的能量會進(jìn)一步碎裂成較小質(zhì)量的多種碎片離子和中性粒子，它們在加速電場作用下獲取具有相同能量的平均動能而進(jìn)入質(zhì)量分析器，質(zhì)量分析器是將同時(shí)進(jìn)入其中的不同質(zhì)量的離子，按質(zhì)荷比m/e大小分離的裝置，分離后的離子依次進(jìn)入離子檢測器，采集放大離子信號，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，繪制成質(zhì)譜圖。質(zhì)譜儀種類非常多，包括四級桿質(zhì)譜（QMS）、飛行時(shí)間質(zhì)譜（TOF）、三重四級桿質(zhì)譜（QqQ）、四極離子阱（QTrap）、四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜（QTOF）、離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜（TrapTOF）、靜電場軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap）、線性離子阱質(zhì)譜 (LTQ）。

●非靶向代謝組研究需要采用高分辨率質(zhì)譜，這樣才可以檢測到盡可能多的代謝物，因此一般采用飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（TOF）和靜電場軌道阱質(zhì)譜（Orbitrap），或者是這兩者與其它質(zhì)量分析器的聯(lián)用模式：例如四級桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀（QTOF）。

●靶向代謝組是針對關(guān)注的目標(biāo)代謝物進(jìn)行靶向定量檢測，目前選擇多反應(yīng)離子檢測（MRM）掃描模式的三重四級桿質(zhì)譜（QqQ）是進(jìn)行靶向代謝組準(zhǔn)確定量研究的首選。

Q2什么是正離子模式和負(fù)離子模式？

●不同物質(zhì)的性質(zhì)不同，例如堿性化合物（比如含氮的化合物）易帶正電荷，這些化合物容易加和質(zhì)子形成正電荷離子；而酸性化合物（比如含有羧基-COOH的化合物）易帶負(fù)電荷，這些化合物容易失去質(zhì)子形成負(fù)電荷離子。正離子模式，就是質(zhì)量分析器只掃描正電荷離子而過濾負(fù)電荷離子，進(jìn)而得到正電荷離子的相關(guān)信息，負(fù)離子模式，就是質(zhì)量分析器只掃描負(fù)電荷離子而過濾正電荷離子，進(jìn)而得到負(fù)電荷離子的相關(guān)信息。通常來說不同樣品適合不同的分析模式，容易得到質(zhì)子的樣品適合做正離子模式，容易失去質(zhì)子的樣品適合做負(fù)離子模式，因此需要根據(jù)實(shí)際情況來選擇，也可以兩種模式都選擇。

Q3代謝組學(xué)檢測中 QC樣本如何設(shè)置？如何考察檢測體系的穩(wěn)定性？

●QC樣本是為了保證檢測體系的穩(wěn)定性和重復(fù)性而設(shè)置的，一般是在所有待檢測樣本提取后，取等體積的所有樣本然后混合而成，然后和待檢測樣本一起進(jìn)行檢測，檢測時(shí)每間隔一定數(shù)量的樣本設(shè)置一個(gè)QC樣本。

●可以通過以下方法考察檢測體系的穩(wěn)定性：

a)因?yàn)镼C樣本都是相同的，如果將所有QC樣本的總離子流色譜圖（TIC）進(jìn)行重疊，如果所有QC樣本的TIC能完全重疊，說明檢測體系的穩(wěn)定性良好，生成的數(shù)據(jù)結(jié)果可信。

b)因?yàn)镼C樣本都是相同的，體現(xiàn)在PCA分析圖中，如果所有QC樣本能緊密聚集在一起，說明檢測體系的穩(wěn)定性良好，生成的數(shù)據(jù)結(jié)果可信。

c)在數(shù)據(jù)預(yù)處理后，如果QC樣本中有超過70%的潛在特征峰（化合物）的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（Relative standard deviation，RSD）不超過30%，就說明檢測體系的穩(wěn)定性良好，生成的數(shù)據(jù)結(jié)果可信。

Q4總離子流圖（TIC, total ion chromatogram）和基峰色譜圖（BPC，base peak chromatogram）有什么不同？

●經(jīng)色譜分離后的各物質(zhì)，依次進(jìn)入質(zhì)譜離子源后，電離生成各種質(zhì)荷比的碎片離子，經(jīng)過質(zhì)量分析器分析，進(jìn)入檢測器，收集所有或部分離子的信號，經(jīng)計(jì)算機(jī)處理，得到各種質(zhì)荷比的離子總和及其隨時(shí)間變化的曲線，稱為總離子流色譜圖（TIC），橫坐標(biāo)是離子的生成時(shí)間或連續(xù)掃描的掃描次數(shù)，縱坐標(biāo)是收集存儲離子的電流總強(qiáng)度。

●經(jīng)色譜分離流出的組分持續(xù)進(jìn)入質(zhì)譜，質(zhì)譜不斷掃描采集數(shù)據(jù)，每次掃描獲得一張圖譜，基峰色譜圖（BPC，base peak chromatogram）就是將每一個(gè)時(shí)間點(diǎn)選擇信號最強(qiáng)的那個(gè)離子連續(xù)描繪得到的圖譜，其中橫坐標(biāo)是保留時(shí)間(RT, retention time)，即組分從進(jìn)樣開始到出現(xiàn)濃度最大值時(shí)所需的時(shí)間，該值用于定性分析（因?yàn)椴煌奈镔|(zhì)出峰時(shí)間不一樣），而縱坐標(biāo)是離子強(qiáng)度，用于定量分析（同一物質(zhì)濃度不同，那么峰面積或者峰高也就不一樣）。

●TIC和BPC都能反映樣品代謝物信息，但是有的學(xué)者認(rèn)為TIC圖才能真實(shí)反映樣品信息，所以更偏向接受TIC。

Q5代謝組學(xué)分析中常用的PCA、PLS-DA和OPLS-DA有什么區(qū)別？

●PCA(Principal Components Analysis)，即主成分分析，也稱主成分回歸分析法，是一種非監(jiān)督（即計(jì)算的時(shí)候沒有分組信息）的數(shù)據(jù)降維（減少數(shù)據(jù)集的維數(shù)，例如三維變?yōu)槎S）分析方法，非監(jiān)督方法是用來探索完全未知數(shù)據(jù)的方法，對原始數(shù)據(jù)依據(jù)樣本特性進(jìn)行分類，把相似性的數(shù)據(jù)進(jìn)行歸類，因而相對于監(jiān)督性的模型分析方法如PLS-DA分析來說，PCA可以更真實(shí)地反映組間的差異。

●PLS-DA ( Partial Least Square-Discriminant Analysis )， 即偏最小二乘判別分析法，是一種監(jiān)督（即計(jì)算的時(shí)候有分組信息）的多元統(tǒng)計(jì)分析方法，它在降維的同時(shí)結(jié)合了代謝物變化和實(shí)驗(yàn)分組之間的回歸模型，并利用一定的判別閾值對回歸結(jié)果進(jìn)行判別分析。相對于PCA，PLS-DA分析可以進(jìn)一步顯示組間的差異。

●OPLS-DA（Orthogonal Partial Least Squares Discrimination Analysis），即正交偏最小二乘判別分析，是PLS-DA的延伸， OPLS-DA會把與實(shí)驗(yàn)條件無關(guān)的變化過濾，因此OPLS-DA比PLS-DA更能體現(xiàn)與實(shí)驗(yàn)條件有關(guān)的樣品差異，因此OPLS-DA比PCA和PLS-DA能使組間樣本分離效果更佳，一般PLS-DA可以用于兩組及以上組別的比較，而OPLS-DA通常用于兩組的比較。此外，在篩選差異代謝物方面，OPLS-DA 比PLS-DA更準(zhǔn)確，一般使用OPLS-DA生成的VIP值去篩選差異代謝物。

Q6PLS-DA模型的R2X、R2Y和Q2分別代表什么意思？

●評價(jià)PLS-DA 模型會用到R2X、R2Y和Q2這三個(gè)指標(biāo)， R2X和R2Y分別表示PLSDA模型能夠解釋X 和Y 矩陣信息的百分比，Q2通過交叉驗(yàn)證計(jì)算得出，用于評價(jià)PLS-DA 模型的預(yù)測能力，這些指標(biāo)越接近1說明PLS-DA 模型越好，一般來說，R2和Q2值大于0.5說明模型較好，如果小于0.5也可以接受，只是模型比較弱。

 Q7PLS-DA模型的置換檢驗(yàn)圖是什么？

●雖然相對于PCA，PLS-DA分析可以更大限度顯示組間的差異，但是有監(jiān)督的分類模型缺點(diǎn)是可能會出現(xiàn)過擬合（是指為了得到一致假設(shè)而使假設(shè)變得過度嚴(yán)格），因此需要驗(yàn)證PLS-DA模型的可靠性，一般使用置換檢驗(yàn)（Permutation test）檢驗(yàn)PLS-DA模型是否存在過擬合，如果過擬合則說明該P(yáng)LS-DA模型不準(zhǔn)確，那么基于PLS-DA模型得到VIP值不適合用于后期的差異代謝物篩選，而判斷PLS-DA模型是否過擬合的標(biāo)準(zhǔn)是：如果Q2的回歸線在縱坐標(biāo)上的截距小于0則說明不存在過擬合，PLS-DA模型比較可靠。

PLS-DA模型的置換檢驗(yàn)圖

Q8篩選差異代謝物的標(biāo)準(zhǔn)是什么？ 

●篩選差異代謝物通用的標(biāo)準(zhǔn)是：VIP（Variable Importance in the Projection）值>1同時(shí)p值＜0.05。其中p值（t 檢驗(yàn)顯著性程度值）來源于單變量分析方法（t檢驗(yàn)），而VIP值（PLSDA的變量投影重要性）來源于多變量分析方法（OPLS-DA模型），物質(zhì)的VIP值越大，說明該物質(zhì)對造成組間差異的貢獻(xiàn)度越大，這說明VIP值相對于p值只關(guān)注物質(zhì)本身在組間的差異程度，其更關(guān)注對造成組間差異的貢獻(xiàn)程度，因此同時(shí)結(jié)合單變量分析方法和多變量分析方法可以使結(jié)果更加可靠。

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