10x Genomics單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序最新2篇文章分享

發(fā)稿時(shí)間：2020-05-22來(lái)源：天昊生物

在往期的分享中我們?cè)榻B過單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（snRNA-seq）的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)（單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序：一定程度上解決單細(xì)胞樣本處理難度），從目前的文獻(xiàn)檢索結(jié)果來(lái)看，單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序已經(jīng)被廣泛用于腦組織、心臟組織、腎臟組織以及多種類型腫瘤組織的研究中。值得注意的是10xGenomics公司的Chromium系統(tǒng)也能很好地應(yīng)用于單細(xì)胞核樣本的建庫(kù)過程中，應(yīng)用10xGenomics平臺(tái)進(jìn)行單核轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)測(cè)序的文章也是越來(lái)越多，其中2020年4月27日Nature Neuroscience雜志在線背靠背發(fā)表了2篇應(yīng)用單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的研究論文。

第一篇文章利用單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在阿爾茨海默癥（AD）小鼠模型中發(fā)現(xiàn)了一群疾病相關(guān)聯(lián)的星形膠質(zhì)細(xì)胞，這些細(xì)胞出現(xiàn)在疾病的早期階段，并隨著疾病進(jìn)展其豐度會(huì)增加，并且在老化的野生型小鼠和老化的人腦中也發(fā)現(xiàn)了相似的細(xì)胞。

研究人員對(duì)7月齡的野生型（WT）或轉(zhuǎn)基因AD小鼠模型（5xFAD）的海馬利用單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序構(gòu)建了細(xì)胞-分子圖譜，共計(jì)8只小鼠的54,769個(gè)高質(zhì)量的細(xì)胞核（圖1A）。將這些細(xì)胞共分成23個(gè)簇（圖1B），WT和AD之間大部分細(xì)胞顯示出相似性，部分細(xì)胞群表現(xiàn)出差異性（圖1C）。AD與WT相比星形膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)有顯著差異（圖1C），AD小膠質(zhì)細(xì)胞狀態(tài)也有顯著差異，其發(fā)生頻率隨疾病進(jìn)展而增加（圖1C），包括疾病相關(guān)小膠質(zhì)細(xì)胞群（DAM）。AD周細(xì)胞/內(nèi)皮細(xì)胞的頻率增加（P < 0.01，圖1C），而新近激活的錐體神經(jīng)元減少（P < 0.01，圖1C），一些罕見基質(zhì)細(xì)胞群的頻率也降低了（P < 0.01，圖1C）。

AD和WT中的星形膠質(zhì)細(xì)胞軌跡分析顯示出連續(xù)變化的三種轉(zhuǎn)錄狀態(tài)（圖1D）。這些細(xì)胞分為6個(gè)轉(zhuǎn)錄子簇（圖1D、E），AD和WT之間在不同狀態(tài)下的細(xì)胞比例不同（圖1F），只在AD中出現(xiàn)了一種獨(dú)特的狀態(tài)。在AD中發(fā)現(xiàn)了一種額外的星形膠質(zhì)細(xì)胞Gfap高（Gfap-high）的狀態(tài)，稱之為疾病相關(guān)星形膠質(zhì)細(xì)胞（DAA，圖1F）。此外，cluster 5（在WT和AD中）表現(xiàn)出Gfap-low和Gfap-high狀態(tài)之間的過渡樣中間狀態(tài)（cluster 6），而cluster 3在AD中頻率顯著增加（圖1F），表現(xiàn)出Gfap-low狀態(tài)和DAA之間的過渡樣中間狀態(tài)（cluster 4，圖1D、E）。

圖1 海馬區(qū)細(xì)胞圖譜顯示出AD中獨(dú)特的DAAs

在WT和AD中觀察到的Gfap-high星形膠質(zhì)細(xì)胞群和AD中獨(dú)特的DAA群與低Gfap-low星形膠質(zhì)細(xì)胞相比，共享大量的上調(diào)的基因（圖2A、B）以及少量下調(diào)的基因（圖2A）。Gfap-high和DAA群中上調(diào)的基因參與發(fā)育和分化、代謝途徑（脂類、膽固醇）、對(duì)有毒化合物的反應(yīng)和炎癥信號(hào)（圖2B）。

為了將DAAs與以往描述的星形膠質(zhì)細(xì)胞特征聯(lián)系起來(lái)，對(duì)組織（bulk）數(shù)據(jù)RNA表達(dá)水平進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)與WT相比，AD星形膠質(zhì)細(xì)胞總體上有泛反應(yīng)和炎癥/A1星形膠質(zhì)細(xì)胞特征的表達(dá)增加，但沒有顯示缺血/ A2星形膠質(zhì)細(xì)胞特征的增加（圖2C）。在239個(gè)DAA特征基因和213個(gè)先前描述的DAM特征基因間有18個(gè)共享的基因，這些基因包括AD風(fēng)險(xiǎn)基因Apoe和Ctsb、Ctsd及Ctsl基因，編碼與AD發(fā)病有關(guān)的蛋白（圖2D）。研究人員為了驗(yàn)證在蛋白水平上DAA的存在，利用免疫熒光對(duì)WT和5xFAD模型中海馬區(qū)相關(guān)marker蛋白進(jìn)行染色，結(jié)果證實(shí)了一些marker的特異性（圖2E-H）。

圖2 DAAs與不同的分子途徑相關(guān)聯(lián)，在定位上靠近Aβ斑塊

為了確定疾病進(jìn)展過程中發(fā)生的變化，對(duì)不同年齡的AD和WT小鼠進(jìn)行單核轉(zhuǎn)錄組分析(1.5-2、4-5、7-8、10、13-14和20個(gè)月大，28只小鼠，23,863個(gè)星形膠質(zhì)細(xì)胞核；圖3A)。據(jù)報(bào)道，從4個(gè)月開始，AD的小膠質(zhì)細(xì)胞頻率在所有測(cè)試時(shí)間點(diǎn)都高于WT，并隨年齡增長(zhǎng)而增加(圖3B)。在WT小鼠(1.5-10個(gè)月大)和AD幼鼠(1.5-2個(gè)月大)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞沿著相同的連續(xù)軌跡分布，橫跨Gfap-low到Gfap-high的狀態(tài)(圖3C)。然而，在AD中，從4個(gè)月大開始，在出現(xiàn)認(rèn)知下降之前，Gfap-low星形膠質(zhì)細(xì)胞一致減少，DAAs相應(yīng)增加((圖3D))。結(jié)果表明，在AD小鼠模型中，DAAs在認(rèn)知功能下降前就出現(xiàn)，并隨疾病進(jìn)展而增加。

從擴(kuò)散圖(圖1D、3C)可以看出，Gfap-low星形膠質(zhì)細(xì)胞是Gfap-high星型膠質(zhì)細(xì)胞和DAAs的潛在來(lái)源(圖3C)。為了探索這種可能性，研究人員又設(shè)計(jì)了一個(gè)計(jì)算程序來(lái)推斷細(xì)胞狀態(tài)之間的轉(zhuǎn)換，最終發(fā)現(xiàn)Gfap-low細(xì)胞是cluster 3中細(xì)胞的主要來(lái)源，cluster 3和cluster 5中的細(xì)胞是相鄰時(shí)間點(diǎn)間DAAs的主要來(lái)源(cluster 4，圖3E-G)。對(duì)不同時(shí)間點(diǎn)clusters間每個(gè)過渡態(tài)相關(guān)的高表達(dá)基因進(jìn)行提取，這些高顯著性基因揭示了一組獨(dú)特的DAA標(biāo)記(圖3H)，這與差異表達(dá)的分析一致(圖2A)。

圖3 DAAs來(lái)源于內(nèi)穩(wěn)態(tài)的Gfap-low星形膠質(zhì)細(xì)胞并隨年齡增長(zhǎng)

第二篇文章則是利用單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)在重度抑郁癥患者的前額皮質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞和興奮性神經(jīng)元。

重度抑郁癥(MDD)對(duì)全球性疾病負(fù)擔(dān)有巨大影響，影響著全世界數(shù)百萬(wàn)人，近30年來(lái)一直是導(dǎo)致殘疾的主要原因。過去對(duì)MDD的分子研究使用的是死后腦組織的大塊勻漿，這掩蓋了單個(gè)細(xì)胞類型中的基因表達(dá)變化。因此這項(xiàng)研究使用單核轉(zhuǎn)錄組來(lái)檢測(cè)男性MDD患者(n = 17)和健康對(duì)照組(n = 17)的背外側(cè)前額皮質(zhì)的約80,000個(gè)核。最終確定了26種細(xì)胞簇，其中超過60%的細(xì)胞簇在組間表現(xiàn)出不同的基因表達(dá)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，最嚴(yán)重的失調(diào)發(fā)生在深層興奮性神經(jīng)元和未成熟少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞(OPCs)，這些細(xì)胞幾乎貢獻(xiàn)了所有基因表達(dá)變化的一半(47%)。這些結(jié)果突出了解剖細(xì)胞類型特異性對(duì)該病貢獻(xiàn)的重要性，并為確定新的研究途徑和新的治療目標(biāo)提供了機(jī)會(huì)。

文章的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如圖1所示，對(duì)34例前額皮質(zhì)樣本進(jìn)行單核轉(zhuǎn)錄組測(cè)序和分析后，分別利用FANS（熒光輔助的核分選）高通量qPCR和RNAScope熒光原位雜交對(duì)差異表達(dá)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

圖1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程

對(duì)背外側(cè)前額皮質(zhì)的細(xì)胞核基因表達(dá)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析共發(fā)現(xiàn)26種不同的細(xì)胞類型，主要包括興奮性/抑制性神經(jīng)元，星型膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞，少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞等（圖2），并對(duì)少突膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行了發(fā)育軌跡重建（圖2E）。

圖2 細(xì)胞類型識(shí)別

然后將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組每個(gè)cluster進(jìn)行基因表達(dá)差異分析，25個(gè)cluster中16個(gè)cluster共計(jì)96個(gè)基因存在差異表達(dá)（FDR < 0.10，圖3A），除了1個(gè)cluster外所有的抑制性神經(jīng)元cluster均有差異基因，而非神經(jīng)元的cluster中既有上調(diào)也有下調(diào)的基因（圖3B）。特別的是，兩個(gè)cluster——未成熟的OPCs（OPC2）和深層興奮性神經(jīng)元（Ex7）占據(jù)了近一半（47%）的差異表達(dá)基因（圖3C）。作者并將自己的數(shù)據(jù)與以往的發(fā)現(xiàn)進(jìn)行了比較（圖3D、E）。

圖3 差異表達(dá)基因分析

進(jìn)一步對(duì)細(xì)胞類型特異性的差異表達(dá)基因進(jìn)行功能富集分析以及加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA），并對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行FANS qPCR驗(yàn)證。隨后對(duì)cluster之間進(jìn)行配體和受體關(guān)聯(lián)分析，利用RNAScope熒光原位雜交技術(shù)對(duì)選擇的marker基因進(jìn)行驗(yàn)證。具體內(nèi)容和結(jié)果詳見原文。

關(guān)于天昊

天昊生物已經(jīng)完成包括神經(jīng)組織、腎臟組織和心臟組織在內(nèi)的多種類型樣本的單細(xì)胞核文庫(kù)制備和測(cè)序，期待與您的合作！