相對豐度會歪曲實際豐度，聯(lián)合16S擴(kuò)增子測序和總菌qPCR獲得的絕對豐度可靠嗎？

發(fā)稿時間：2020-06-02來源：天昊生物

英文題目: Complementing 16S rRNA Gene Amplicon Sequencing with Total Bacterial Load To Infer Absolute Species Concentrations in the Vaginal Microbiome

中文題目：聯(lián)合16S擴(kuò)增子測序與總細(xì)菌負(fù)荷，推斷生殖道菌群物種的絕對豐度。

期刊名：mSystems

影響因子：6.519 

發(fā)表時間：2020年

發(fā)表單位：華盛頓大學(xué)弗雷德哈欽森癌癥研究中心疫苗和傳染病部

研究摘要:

盡管16S擴(kuò)增子測序可定量分析細(xì)菌類群的相對豐度，但樣品之間總細(xì)菌負(fù)荷的差異限制了其反映單個細(xì)菌物種絕對豐度的能力。qPCR可以定量單個物種的絕對豐度，但是針對存在于不同樣品中的每種細(xì)菌開發(fā)一套qPCR檢測方法是不切實際的。我們想確定使用總細(xì)菌負(fù)荷和相對豐度相結(jié)合的方法來推斷細(xì)菌絕對豐度是否準(zhǔn)確可靠。我們分析了來自20名有細(xì)菌性生殖道病史的女性的1320份樣本，這些女性在60天內(nèi)每天自行收集生殖道拭子樣本。我們通過獲取物種相對豐度（通過16S擴(kuò)增子測序獲得）和總細(xì)菌載量（通過細(xì)菌16S通用引物 qPCR獲得）的乘積來推斷每個細(xì)菌的絕對豐度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)Log ₁₀轉(zhuǎn)化得到的絕對豐度與七種特定細(xì)菌的特異引物靶向qPCR得到的絕對豐度相關(guān)。>0.5-log₁₀的誤差中有92％是由相對豐度低于10%的物種引起的，許多誤差發(fā)生在細(xì)菌從早期增殖或后期收縮到低豐度的過程中。當(dāng)一個物種的相對豐度大于10％時，基于兩種技術(shù)聯(lián)合推斷的絕對豐度是可以代替靶向qPCR的檢測結(jié)果。但是，靶向qPCR更適合檢測相對豐度低的細(xì)菌，并且對于表征單個物種的生長和衰變動力學(xué)靶向qPCR是第一選擇。

研究意義：

微生物組研究主要使用16S rRNA擴(kuò)增子測序來評估細(xì)菌類群的相對豐度。但是16S rRNA擴(kuò)增子測序不能準(zhǔn)確反映物種的絕對豐度。本研究試圖確定通過細(xì)菌16S通用引物 qPCR獲得總細(xì)菌載量和16S rRNA擴(kuò)增子測序獲得的物種相對豐度的兩者乘積是否可以準(zhǔn)確地代替特異性qPCR所檢測的單個物種的絕對豐度?？傮w而言，基于兩種技術(shù)聯(lián)合推斷的特定物種的絕對豐度在某種程度上是物種特異性qPCR檢測結(jié)果的合理替代，尤其是當(dāng)細(xì)菌以較高的相對豐度存在時。這種方法提供了一個機(jī)會來評估細(xì)菌物種的絕對豐度，而無需為每個特定物種開發(fā)單獨(dú)的qPCR分析方法。

研究背景:

對于大多數(shù)傳染病，單一病原體的絕對豐度通常是疾病嚴(yán)重程度和治療反應(yīng)的最具體標(biāo)志。相比之下，細(xì)菌群落的研究通常依賴于基于16S rRNA基因擴(kuò)增的NGS測序來評估細(xì)菌的相對數(shù)量，而非絕對數(shù)量。在機(jī)制層面上，細(xì)菌和細(xì)菌基因產(chǎn)物的特定組合被認(rèn)為在許多微生物相關(guān)疾病的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，這種表征微生物群的方法很有價值。但是，與這些微生物分類群的相對豐度相比，單個細(xì)菌分類群的絕對豐度可能是疾病風(fēng)險的更好預(yù)測指標(biāo)。使用qPCR定量單個物種的絕對豐度是很費(fèi)時的，不但要求使用已知濃度的內(nèi)標(biāo)DNA生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，而且價格昂貴，并且只能在專門實驗室中使用；此外，每種qPCR分析都需要大量開發(fā)和驗證成本，因此，qPCR不適合檢測群落中的所有物種的絕對豐度。此外，選擇最適合分析的物種可能反映出研究者的偏向性。

從NGS數(shù)據(jù)推斷多種細(xì)菌物種絕對豐度的方法未來在微生物組研究領(lǐng)域非常有用，包括生殖道微生物組的研究。擴(kuò)增子測序已用于幫助確定細(xì)菌性生殖道疾病，其它性傳播疾病以及早產(chǎn)風(fēng)險增加的條件。然而，即使在一天的過程中，個體之間和個體內(nèi)部的總細(xì)菌負(fù)荷也可能隨著時間的推移而發(fā)生顯著變化，因此，相對豐度無法準(zhǔn)確代表絕對豐度，因此，最近腸道微生物組研究結(jié)果顯示，相對豐度可能會給出虛假的疾病關(guān)聯(lián)結(jié)果，而這些虛假的疾病關(guān)聯(lián)實際上可能是由不同個體間總微生物負(fù)荷差異所引起的。

在這里，我們證明了將相對豐度數(shù)據(jù)乘以通過qPCR測得的總細(xì)菌負(fù)荷所得到的推斷值，可以為每個樣品中特定物種的細(xì)絕對豐度提供有用的參考。在這里，我們通過與物種靶向qPCR測定的陰道微生物組中7個關(guān)鍵物種的絕對豐度相比較來驗證上述推斷的絕對豐度估計值的準(zhǔn)確性。我們發(fā)現(xiàn)，雖然推斷的絕對豐度估計值對于大多數(shù)樣品都是準(zhǔn)確的，但當(dāng)物種的相對豐度較低時，這種聯(lián)合分析得到的推斷的絕對豐度估計值很容易出錯，并且可能在從低細(xì)菌豐度增殖時期和后期收縮到低豐度的過程中可能會歪曲單個物種的動力學(xué)。

研究結(jié)果：

縱向剖面的比較突出了相對豐度和絕對豐度之間的差異

在研究過程中，我們比較了同一樣本的絕對濃度和相對豐度。圖1a和b顯示了單個參與者的細(xì)菌動力學(xué)，所顯示的個體經(jīng)歷了細(xì)菌譜的動態(tài)變化，并在低多樣性狀態(tài)到高多樣性狀態(tài)之間發(fā)生了顯著變化。

單一物種當(dāng)用qPCR檢測時，結(jié)果變化和擴(kuò)增子測序檢測結(jié)果變化不同，例如，對于圖1中所示的參與者，A. vaginae的絕對豐度在第17天（h 415）突然增加，但是相對豐度直到第28天（h 671），才顯示出突然增加。從第0天到第7天（h 168），受試者接受甲硝唑治療細(xì)菌性陰道炎（BV）： qPCR顯示BV相關(guān)物種的絕對豐度呈指數(shù)下降；然而，擴(kuò)增子測序則顯示受試者經(jīng)過治療更迅速地向Lactobacillus iners轉(zhuǎn)化。

另外，擴(kuò)增子測序的相對豐度也無法捕獲細(xì)菌的低水平定植，例如擴(kuò)增子測序在第6至11天（h 150和261）不能發(fā)現(xiàn)Gardnerella vaginalis的定殖，而靶向qPCR則可以發(fā)現(xiàn)Gardnerella vaginalis的定殖。如前所述，高多樣性狀態(tài)通常與Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, BVAB2, Megasphaera的高絕對豐度同時出現(xiàn)，這些都與細(xì)菌性陰道炎（BV）相關(guān)。

這些觀察結(jié)果強(qiáng)調(diào)靶向qPCR為測量單個物種的動力學(xué)提供了更精準(zhǔn)的評價，而擴(kuò)增子測序是估計高多樣性群落中細(xì)菌多樣性的最佳方法。

圖1 參與者生殖道生態(tài)位的復(fù)雜細(xì)菌動力學(xué)。對一名18歲女性每日采集的生殖道拭子樣本進(jìn)行分析：（a）針對七個特定物種的定向qPCR；（b）16S擴(kuò)增子測序；（c）相對豐度超過1%的物種的絕對豐度推斷值。方框表示已使用qPCR對特定菌進(jìn)行了檢測。推斷的絕對豐度比相對豐度更接近靶向qPCR檢測結(jié)果，并且可以預(yù)測無法進(jìn)行靶向qPCR檢測的物種的絕對豐度。

 

噪聲檢測分析表明采樣方差對觀察到的動態(tài)影響有限

接下來，我們試圖評估觀察到的qPCR值變化是否是采樣或?qū)嶒炇铱勺冃韵嚓P(guān)的噪聲造成的結(jié)果，而不是由于豐度的真實變化所致。我們從絕對豐度的縱向數(shù)據(jù)中估計采樣噪聲。該技術(shù)將數(shù)據(jù)分解為兩個部分：信號（樣品中的真實豐度）和噪聲，噪聲來源可能是生物學(xué)的，技術(shù)的，采樣的或這些的任意組合。在圖3a和b中，我們展示了兩個參與者的L.iners和BVAB2的縱剖面，我們發(fā)現(xiàn)檢測到的信號（紅色顯示）與qPCR測量數(shù)據(jù)（黑色顯示）非常接近，只有輕微的偏差，在所有其他參與者以及每個物種中都發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢。在圖3c和d中，我們展示了檢測到的L.iners和BVAB2的噪聲在所有參與者中的分布，檢測到的噪聲平均值為零，方差很小，在細(xì)菌總數(shù)和所有其他物種中也發(fā)現(xiàn)了同樣的情況。

在我們的研究中，觀察到物種發(fā)生了高達(dá)8.2 log ₁₀的變化，細(xì)菌總負(fù)荷在60天內(nèi)可以改變4.9 log₁₀，這些觀察到的變化比我們估計的噪聲要大得多，這表明捕捉到的動力學(xué)很可能是生物的，而不是噪聲。

圖3 噪聲檢測分析表明采樣方差很小，給出了兩個縱剖面的信號和噪聲分解，來自靶向qPCR分析的測量用黑色表示，由25%低通濾波器檢測到的信號用紅色表示，用于單獨(dú)參與者中的L.iners（a）和BVAB2（b）。在這兩種情況下，信號與絕對豐度測量值非常匹配。

 

推斷的絕對豐度是qPCR測量的絕對豐度的預(yù)測值

對于每個物種的絕對豐度，我們通過將細(xì)菌總負(fù)荷乘以擴(kuò)增子測序得到的相對豐度來推斷，如方程式1所示。然后，我們將推斷值與七個關(guān)鍵物種的靶向qPCR所測量的絕對豐度進(jìn)行了比較。對于每個物種，在大多數(shù)樣品中推斷出的細(xì)菌絕對豐度與qPCR所測量的絕對豐度很類似（圖1c；圖2中的虛線）。在許多情況下，對于大多數(shù)物種，沒有明顯的極端不一致（圖2a）。然而，對于某些物種，如Megasphaera和BVAB2，推斷的細(xì)菌絕對豐度始終高于qPCR所測量的絕對豐度一個數(shù)量級（圖2b）。在一組樣本中，對于所有物種，推斷的細(xì)菌絕對豐度為零，而qPCR水平為正，導(dǎo)致推斷的細(xì)菌絕對豐度和qPCR所測量的絕對豐度之間的嚴(yán)重不一致：這通常在低絕對豐度情況下出現(xiàn)（圖2）。

其中IC是推斷的絕對豐度，RA是相對豐度，TBL是細(xì)菌總負(fù)荷。

 

圖2 由于細(xì)菌總負(fù)荷的變化，相對豐度估計可能會歪曲實際豐度。兩名受試者中兩種不同物種的物種特異性特征的示例：crispatus，受試者06（a）和Megasphaera，受試者17（b）。垂直條顯示相對豐度（%，左y軸），實線表示qPCR測量的絕對豐度，灰色線表示細(xì)菌總負(fù)荷，虛線表示推斷豐度（右y軸）。黑色虛線表示qPCR數(shù)據(jù)的檢測閾值。箭頭表示相對豐度變化與絕對豐度變化不一致的時間點，這通常發(fā)生在細(xì)菌負(fù)荷急劇變化或相對豐度較低時。

 

我們比較了相對豐度和qPCR所測量的絕對豐度之間的相關(guān)系數(shù)（圖4a），還有就是推斷的絕對豐度和qPCR所測量的絕對豐度之間的相關(guān)系數(shù)（圖4b），結(jié)果發(fā)現(xiàn)與相對豐度相比，推斷的絕對豐度與qPCR所測量的絕對豐度的相關(guān)性略有改善。

圖4 與相對豐度相比，推斷的絕對豐度與qPCR所測量的絕對豐度的相關(guān)性略有改善。（a）絕對濃度與相對豐度的散點圖。（b）絕對濃度與推斷的絕對豐度的散點圖。

 

但是我們注意到物種間的相關(guān)性，在qPCR所測量的絕對豐度和推斷的絕對豐度之間的相關(guān)系數(shù)中，Megasphaera 和BVAB2的相關(guān)系數(shù)最強(qiáng)，其次是L. crispatus, A. vaginae和 L. jensenii。 G. vaginalis 和 L. iners的相關(guān)性最弱 （表1）。

表1單一物種的qPCR所測量的絕對豐度與相對豐度的相關(guān)系數(shù)，以及qPCR所測量的絕對豐度和推斷濃度之間的相關(guān)系數(shù) 。

 

我們定義推斷的絕對豐度為IC，如等式2所示。雖然推斷的絕對豐度誤差（IC error）的范圍很大（圖5a），但平均推斷的絕對豐度誤差和標(biāo)準(zhǔn)偏差較低。此外，在四分位范圍內(nèi)（IQR）的樣本中，大多數(shù)物種的推斷的絕對豐度誤差中位數(shù)接近于零，表明推斷的絕對豐度誤差很?。▓D5a）。但是，對于BVAB2和Megasphaera，推斷的絕對豐度誤差的四分位范圍雖然很窄，但絕對豐度誤差都小于0，這意味著推斷的絕對豐度高估了其真實絕對豐度。使用推斷的絕對豐度，還有一種可能是低估了G. vaginalis的絕對豐度（圖5a）。

其中IC是推斷的絕對豐度，AC是絕對豐度。

 

圖5 與絕對豐度相比，較低的細(xì)菌相對豐度是推斷的絕對豐度誤差的主要預(yù)測因子。 （a）顯示推斷的絕對豐度誤差的箱式圖，其中推斷的絕對豐度為零，表明總體上誤差低；（b）相對豐度組的大于0.5的IC誤差的條形圖。黑色柱子包括雙重負(fù)數(shù)樣本（推斷的絕對豐度為零和qPCR所測量的絕對豐度為閾值）：大于0.5的IC誤差中93％由相對豐度低于10%的物種引起（85%是由相對豐度低于1%的物種引起的），灰色柱子是刪除了雙重負(fù)數(shù)樣本：在大于0.5的IC誤差中僅有85%是由相對豐度低于10%的物種引起的（66%是由相對豐度低于1%的物種引起的）；（c） 箱式圖顯示未確認(rèn)和確認(rèn)的總細(xì)菌載量被低估的樣品（通過16S通用引物qPCR測得的總細(xì)菌載量低于通過靶向qPCR測得的所有七個菌種絕對豐度的總和的樣本）的IC誤差。推斷豐度為零的數(shù)據(jù)點被刪除?？偧?xì)菌負(fù)荷被低估的樣品比其它樣品高估了單一物種的豐度。

 

低相對豐度是推斷的絕對豐度誤差的主要來源

結(jié)果顯示，特異性細(xì)菌相對豐度越低，推斷的絕對豐度誤差范圍越高（圖4b）。因此，在大于0.5的IC（推斷的絕對豐度）誤差中，93%是由相對豐度低于10%的物種引起的，85%是由相對豐度低于1%的物種引起的。這些IC誤差中有許多由這些雙重負(fù)數(shù)樣品（推斷的絕對豐度為零且qPCR所測量的絕對豐度為閾值的樣品）引起的，從分析中刪除這些樣品后，在大于0.5的IC誤差中，僅有85%是由相對豐度低于10%的物種引起的，僅有66%是由相對豐度低于1%的物種引起的（圖5b）。

當(dāng)qPCR檢測的絕對豐度值等于或低于檢測閾值時，我們將假陽性樣本定義為非零推斷豐度值；當(dāng)qPCR檢測的絕對豐度值高于檢測閾值時，我們將假陰性樣本定義為零推斷豐度值。假陰性（23.6%）比假陽性（3.17%）更為常見，說明靶向qPCR比NGS更靈敏。不同物種間假陰性的發(fā)生率并不相同，其中G. vaginalis的假陰性率最高，其次是L. inners 和A. vaginae。一些物種的假陰性率較高，因為它們通常出現(xiàn)在中等濃度下，接近相對豐度誤差閾值。假陰性樣本的qPCR中位數(shù)為3.92log₁₀（每個拭子16S rRNA基因拷貝數(shù)）（IQR，2.88到4.82；范圍，1.97到7.84），再次表明IC誤差通常發(fā)生在較低的細(xì)菌負(fù)荷下。

通過16S通用引物qPCR測得的總細(xì)菌載量通常低于通過靶向qPCR測得的所有七個菌種絕對豐度的總和，這些總細(xì)菌負(fù)荷被低估的樣品比其它樣品高估了單一物種的豐度（圖5c）。例如從這些細(xì)菌總負(fù)荷被低估的樣本中得出的非零推斷豐度為0.171 log₁₀（每個拭子16S rRNA基因拷貝數(shù)），平均IC誤差（IQR，-0.138至0.447；范圍為–7.31至2.66），而其它樣本的非零推斷豐度則為-0.368 log ₁₀（每個拭子16S rRNA基因拷貝數(shù)），平均IC誤差（IQR，為-0.638至-0.143；范圍為-6.54至1.42）。

L. crispatus的假陽性率最高。 所有樣本中假陽性的平均相對豐度非常低，為0.06％（IQR，0.04至0.11％；范圍，0.0007至36.8％）。

 

推斷的絕對豐度與樣品多樣性或測序深度無關(guān)

根據(jù)香農(nóng)多樣性指數(shù)（圖6a），樣品多樣性不影響推斷的絕對豐度（IC）誤差。此外，觀察到測序深度不影響推斷的絕對豐度（IC）誤差（圖6b），因此總的來說，低細(xì)菌相對豐度是推斷的絕對豐度（IC）誤差的主要來源，而與多樣性或測序深度無關(guān)（圖6a和b）。在所有原始物種計數(shù)中均觀察到> 0.5的IC誤差，但最大的IC誤差（> 2）幾乎完全與100以下的原始物種計數(shù)相關(guān)（圖6c）。

圖6 樣品多樣性，測序深度和物種計數(shù)不影響推斷的絕對豐度（IC）誤差。（a）相對豐度與香農(nóng)多樣性指數(shù)。 較高的IC誤差主要發(fā)生在較低的相對豐度上，但在低和高多樣性樣本中均如此。（b）相對豐度與測序深度。 較高的IC誤差主要發(fā)生在較低的相對豐度下，但在測序深度的各個級別上均如此。（c）測序深度與物種數(shù)量。盡管在所有物種計數(shù)中觀察到的IC誤差約為0.5，但在物種數(shù)量低于100時發(fā)生了很高的IC誤差。

 

推斷的絕對豐度估計值可以預(yù)測單個物種細(xì)菌負(fù)荷的大多數(shù)時間變化

接下來，我們通過確定一天中細(xì)菌水平的變化來檢查推斷的絕對豐度是否是評估單個物種動力學(xué)的有用工具。相對豐度的變化率與qPCR檢測的絕對豐度的變化率之間的相關(guān)性很弱，例如在23.2%的時間里，我們觀察到相對豐度的變化與絕對豐度的變化相反（見圖7a的左上和右下象限），這種類型的錯誤通常發(fā)生在最豐富的物種(e.g., L. crispatus)和較稀有的物種（例如BVAB2）。

推斷的絕對豐度的變化率與qPCR檢測的絕對豐度的變化率則顯示出更好的相關(guān)性，例如推斷的絕對豐度將rIC誤差（推斷的絕對豐度引起的變化率誤差）降低了50％以上（從23.2降低到7.97％，圖7b）。

圖7 推斷的絕對豐度允許對兩個連續(xù)樣品之間的動力學(xué)變化進(jìn)行某種程度的準(zhǔn)確推斷。（a）qPCR檢測的絕對豐度變化率與相對豐度變化率的散點圖顯示差的相關(guān)性。觀察到的相對豐度變化的很大一部分與絕對豐度的變化方向相反（左上和右下誤差象限標(biāo)有百分比）。（b）qPCR檢測的絕對豐度變化率與推斷的絕對豐度變化率的散點圖顯示出改善的相關(guān)性，百分比對應(yīng)于落在誤差象限內(nèi)且相對豐度較低的數(shù)據(jù)點。

 

圖8 顯示了A. vaginae絕對豐度水平和樣本間變化的典型輪廓，發(fā)現(xiàn)了數(shù)據(jù)中最常見的兩種類型的rIC誤差：第一個是當(dāng)兩個連續(xù)點之一推斷的絕對豐度為零（單陽性）時會發(fā)生高的陽性率或陰性率，這些點導(dǎo)致對所有樣本中單個物種的早期生長率或后期收縮率的高估（圖7b和8b，右上象限和左下象限），當(dāng)細(xì)菌早期從低豐度增殖或后期收縮到低豐度的過程時，通常會發(fā)生此類rIC誤差。當(dāng)連續(xù)兩個點推斷的絕對豐度為零（雙陰性）時，就會發(fā)生第二種rIC誤差，導(dǎo)致低估了單個物種的早期生長率或后期收縮率（圖8b），當(dāng)細(xì)菌早期從低豐度增殖或后期收縮到低豐度的過程時，通常也會發(fā)生此現(xiàn)象。這兩種rIC誤差占> 0.05 rIC誤差的91.7％（圖8c）。如果所有涉及零值的數(shù)據(jù)都從分析中消除，我們發(fā)現(xiàn)推斷的絕對豐度的變化率與qPCR檢測的絕對豐度的變化率之間存在極好的相關(guān)性（圖8b）。因此，當(dāng)細(xì)菌豐度較低或使用不太靈敏的16S通用引物PCR和NGS方法無法檢測到時，推斷的絕對豐度在微生物早期生長或后期收縮不能捕獲準(zhǔn)確的動力學(xué)。然而，當(dāng)細(xì)菌以較高的豐度存在時（例如每個拭子中的16S rRNA基因總拷貝數(shù)>10⁶），推斷的絕對豐度可用于估計單個物種的生長率和收縮速率。

圖8推斷的絕對豐度可以準(zhǔn)確推斷兩個連續(xù)非陰性樣品之間的動力學(xué)變化。（a，頂部）單個受試者A. vaginae隨時間變化（虛線表示推斷的絕對豐度，實線表示qPCR檢測的絕對豐度）；（a，底部）同一受試者A. vaginae隨時間變化的速率。只有當(dāng)一個連續(xù)樣本中的推斷的絕對豐度為零時，推斷的絕對豐度和qPCR檢測的絕對豐度之間的拭子-拭子水平差異才會變化。（b） 推斷的絕對豐度變化率與qPCR檢測的絕對豐度的散點圖。數(shù)據(jù)與圖7a和b中的數(shù)據(jù)相同，三角形對應(yīng)于圖a。根據(jù)連續(xù)樣本是雙陽性（推斷的絕對豐度均>0推斷濃度）、單陽性（推斷的絕對豐度一個>0和一個為0）還是雙陰性（推斷的絕對豐度均為0），對點進(jìn)行著色。兩個樣本都為正（不為零）的數(shù)據(jù)點的相關(guān)性要高得多。（c） 大多數(shù)rIC誤差>0.05發(fā)生在正、負(fù)樣本（單陽性）之間的轉(zhuǎn)換過程中。