Nature Microbiology：火眼金睛，腸道菌群絕對(duì)定量分析擒“真兇”！

發(fā)稿時(shí)間：2020-05-26來(lái)源：天昊生物

英文題目: Quantitative microbiome profiling disentangles inflammation- and bile duct obstruction-associated microbiota alterations across PSC/IBD diagnoses

中文題目：腸道菌群絕對(duì)定量分析揭示PSC/IBD診斷中與炎癥和膽管阻塞相關(guān)的菌群變化

期刊名：Nature Microbiology

影響因子：14.3

發(fā)表時(shí)間：2020年

單位 :比利時(shí)魯汶大學(xué)微生物學(xué)和免疫學(xué)系Rega研究所

實(shí)驗(yàn)樣本：擴(kuò)增子數(shù)據(jù)：佛蘭德腸道菌群項(xiàng)目隊(duì)列（FGFP；n=1120）中觀察到的非疾病相關(guān)個(gè)體作為健康對(duì)照；106個(gè)原發(fā)性硬化性膽管炎/炎癥性腸?。?span>PSC/IBD）糞便樣本（PSC n=18，克羅恩?。?span>CD）n=29，潰瘍性結(jié)腸炎（UC）n=13，PSC-CD n=20和PSC-UC n=26）。

研究摘要:

最近的研究工作突出了混雜因素控制在微生物組關(guān)聯(lián)研究中的重要性，例如，先前與腸道生態(tài)系統(tǒng)失調(diào)相關(guān)的多種病理表現(xiàn)出糞便濃度的伴隨變化，這是微生物組變化的主要協(xié)變量，在這種情況下，觀察到的微生物群變化可以在很大程度上反映糞便含水量的變化。此外，糞便中的水分變化與糞便微生物負(fù)荷（數(shù)量）的波動(dòng)有關(guān)，從而在相對(duì)豐度分析中誘發(fā)了假象。因此，要鑒定腸道微生物與病理學(xué)中特定疾病表現(xiàn)之間的關(guān)聯(lián)，就需要對(duì)微生物組變異進(jìn)行去混亂和定量評(píng)估。在這里，我們重新審視了包括106例原發(fā)性硬化性膽管炎（PSC）/炎癥性腸?。?span>IBD）患者的微生物組數(shù)據(jù)集，通過(guò)定量微生物分類單元的絕對(duì)豐度，我們?cè)诳刂萍S便水分含量變化前提下研究了患者的微生物組變化，結(jié)果觀察到具有低細(xì)胞計(jì)數(shù)的Bacteroides?2腸型的流行分布率增加，微生物負(fù)荷與腸道和全身炎癥標(biāo)志物水平成負(fù)相關(guān)。絕對(duì)定量分析使我們能夠區(qū)分腸道炎癥嚴(yán)重程度（Fusobacterium）或膽管炎（PSC）/膽道梗阻（Enterococcus）各自特異的微生物標(biāo)記物，這些標(biāo)記物是先前基于相對(duì)定量分析提出的PSC相關(guān)標(biāo)記菌屬。確定并驗(yàn)證了與炎癥相關(guān)的Fusobacterium,Veillonella之間的近乎排斥模式，其中Fusobacterium的檢測(cè)僅限于克羅恩氏病患者和PSC-克羅恩氏病患者?？傮w而言，通過(guò)腸道菌群絕對(duì)定量分析和混雜因素控制，我們選擇了與疾病相關(guān)的真實(shí)的微生物標(biāo)記。

研究結(jié)果：

根據(jù)屬水平菌群組成的個(gè)體間差異，觀察到合并患者組與66名年齡，性別和體重指數(shù)相匹配的FGFP健康對(duì)照組（mHCs）分開(kāi)(圖1a）。在患者和FGFP樣品的屬水平矩陣上使用DMM模型，我們觀察到微生物組數(shù)據(jù)集可以分層為四個(gè)微生物腸型（Ruminococcaceae, Prevotella , Bacteroides 1(B1)，Bacteroides 2 (B2)）。除UC外，所有患者組的腸型流行分布率與mHCs相比均存在差異（圖1b）。雖然11%的mHC樣本為Bacteroides 2 (B2)腸型，但這種有害菌腸型的流行分布率在38%（UC患者）-78%（CD患者）之間變化，PSC和PSC-IBD則處于這個(gè)范圍內(nèi)。

圖1 PSC/IBD隊(duì)列的微生物組成與健康對(duì)照組不同。a,PSC/IBD隊(duì)列和mHCs相對(duì)定量微生物組譜的個(gè)體間差異的主坐標(biāo)分析；b,與健康對(duì)照組相比，患者組中B2腸型的流行分布率較高。

最近，我們報(bào)道了Bacteroides 2 (B2)腸型樣品的微生物密度明顯低于Bacteroides 1(B1), Ruminococcaceae和Prevotella等腸型樣品，在這里，評(píng)估整個(gè)PSC/IBD/mHC隊(duì)列的微生物豐度，我們確認(rèn)B2是一種低細(xì)胞計(jì)數(shù)的腸型。

有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞計(jì)數(shù)在診斷亞組中有差異性分布，PSC-IBD或CD患者的微生物豐度明顯低于MHC對(duì)照（圖2a）。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)并根據(jù)所研究疾病的病理學(xué)，著手研究腸型，糞便微生物細(xì)胞密度和宿主炎癥狀態(tài)之間的潛在聯(lián)系，在PSC/IBD/mHC隊(duì)列中，分別使用糞便鈣衛(wèi)蛋白和血清C反應(yīng)蛋白（CRP）濃度作為腸道和全身炎癥的生物標(biāo)志物，我們發(fā)現(xiàn)在B2型個(gè)體中兩者均升高（圖2b）。

除與炎癥標(biāo)志物有關(guān)外，糞便微生物負(fù)荷還與大便含水量有關(guān)。在本數(shù)據(jù)集中，我們確認(rèn)糞便水分含量隨糞便微生物細(xì)胞密度和腸型的變化而變化，在B2腸型樣本糞便中觀察到最高含水量（圖2c），由于在IBD患者中經(jīng)常觀察到大便疏松并伴有腸道炎癥增加，這些發(fā)現(xiàn)表明與疾病相關(guān)的微生物群改變可能僅由糞便含水量的差異引起。在B2腸型樣本中，我們觀察到的微生物負(fù)荷明顯低于基于水分含量的預(yù)期負(fù)荷（圖2d）。

此外，在預(yù)測(cè)樣本腸型時(shí)，結(jié)合了含水量-炎癥模型的解釋方差與每個(gè)單獨(dú)組成部分涵蓋的方差之和相當(dāng)，表示這兩個(gè)變量對(duì)腸型分化的不重疊貢獻(xiàn)。與其它腸型相比，組合模型在預(yù)測(cè)R和B2腸型方面表現(xiàn)最佳（圖2e）。 總體而言，在PSC和/或IBD患者中普遍存在的B2腸型糞便樣本中觀察到的低細(xì)胞計(jì)數(shù)，不僅反映了糞便疏松，而且與較高水平的腸道炎癥直接相關(guān)。

圖2  PSC和/或IBD診斷標(biāo)記物、糞便細(xì)胞計(jì)數(shù)和炎癥水平之間的關(guān)系。a，各個(gè)患者組之間的微生物負(fù)荷變化；b，通過(guò)糞便鈣衛(wèi)蛋白測(cè)得的腸型之間的腸道炎癥分布；c，糞便水分含量（％）在不同腸型之間的分布；d，微生物負(fù)荷與含水量二次擬合殘差在腸型間的分布；e, 基于鈣衛(wèi)蛋白水平和水分含量預(yù)測(cè)樣品腸型的ROC曲線模型和模型預(yù)測(cè)公式的概率圖。

結(jié)合擴(kuò)增子測(cè)序和流式細(xì)胞儀，絕對(duì)定量菌群分析（QMP）可根據(jù)絕對(duì)豐度而不是相對(duì)比例來(lái)評(píng)估糞便菌群變異。絕對(duì)定量菌群分析（QMP）降低了下游分析中的假陽(yáng)性率和假陰性率，降低了微生物組關(guān)聯(lián)錯(cuò)誤解釋的風(fēng)險(xiǎn)。將QMP應(yīng)用于PSC/IBD/mHC數(shù)據(jù)集，我們確定11個(gè)菌屬與糞便鈣衛(wèi)蛋白濃度顯著相關(guān)（圖3a），大便含水量與45個(gè)微生物分類單元相關(guān)。結(jié)合這兩個(gè)變量，在控制糞便含水量變化時(shí)，11個(gè)與糞便鈣衛(wèi)蛋白濃度相關(guān)的細(xì)菌屬中只有6個(gè)保持顯著性相關(guān)：Anaerostipes (?) , Escherichia (+) , Fusobacterium (+) , Gemmiger (?) ,Streptococcus (+)，Veillonella (+)（圖3a）。

考慮到它們對(duì)疾病嚴(yán)重性的潛在影響，我們對(duì)與鈣衛(wèi)蛋白水平相關(guān)菌屬的豐度進(jìn)行了taxon-taxon相關(guān)性分析，并在獨(dú)立的IBD隊(duì)列中驗(yàn)證了這一發(fā)現(xiàn)（圖3b）。在經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的關(guān)聯(lián)中，我們著重指出在PSC/IBD患者的糞便樣本中，Fusobacterium 和Veillonella（盡管兩個(gè)菌都與糞便鈣衛(wèi)蛋白濃度呈正相關(guān)）之間觀察到了令人驚訝的近乎排斥模式（圖3b）。

圖3  PSC/IBD/mHC隊(duì)列中與糞便水分、膽道梗阻和炎癥水平相關(guān)的定量菌屬分布。a，菌屬絕對(duì)定量豐度與糞便含水量、糞便鈣保護(hù)素濃度、血清ALP水平的相關(guān)性，以及控制糞便含水量時(shí)菌屬絕對(duì)定量豐度與鈣保護(hù)素或ALP水平之間的相關(guān)性。b，控制糞便含水量時(shí)與鈣衛(wèi)蛋白水平相關(guān)菌屬的taxon-taxon相關(guān)性分析；c，僅在兩個(gè)屬（Veillonella和Fusobacterium）之間觀察到的近乎排斥模式，盡管兩者均與腸道炎癥呈正相關(guān)。

雖然在所有疾病組糞便樣本中都發(fā)現(xiàn)Veillonella，但高豐度Veillonella樣本是CD或PSC-CD患者的特異性樣本（圖3b）。有幾項(xiàng)研究探討了Veillonella，特別是Fusobacterium在增強(qiáng)促炎癥環(huán)境中的因果作用，與目前的研究結(jié)果相比，這兩個(gè)屬被報(bào)道在口腔生物膜中共存以增加氧化應(yīng)激抵抗力。亞屬種類分析顯示，在核心PSC/IBD /mHC隊(duì)列中，Veillonella和Fusobacterium的豐度隨著腸道炎癥的增加而增加。

以前，在相對(duì)豐度分析的基礎(chǔ)上，我們確定Enterococcus, Fusobacterium, Lactobacillus是PSC患者的潛在marker菌屬，其在PSC患者和PSC-IBD患者中的相對(duì)豐度均升高。在這里，通過(guò)絕對(duì)定量菌群分析（QMP）確定Fusobacterium只與炎癥有關(guān)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)Enterococcus與血清堿性磷酸酶（ALP）水平特別相關(guān)，ALP是膽管阻塞嚴(yán)重程度的標(biāo)志，即使在消除糞便水分變化的情況下也是如此（圖3a）。QMP分析發(fā)現(xiàn)Lactobacillus與鈣保護(hù)素或ALP之間沒(méi)有明顯的相關(guān)性?？偠灾覀冇纱说贸鼋Y(jié)論，Enterococcus，Escherichia, Fusobacterium, Streptococcus，Veillonella分別是膽管阻塞和胃腸道炎癥的有希望的，特異性的，跨疾病的標(biāo)記物。

研究結(jié)論：

總之，我們顯示了糞便水分含量，糞便鈣衛(wèi)蛋白水平和CRP濃度如何與糞便細(xì)胞計(jì)數(shù)和Bacteroides?2腸型密切相關(guān)。絕對(duì)定量菌群分析（QMP）可以炎癥相關(guān)微生物和與膽道梗阻嚴(yán)重程度相關(guān)微生物區(qū)分開(kāi)來(lái)（大便含水量變化除外），并揭示了炎癥水平較高患者中的Veillonella，Fusobacterium呈現(xiàn)相互排斥的模式?？傊?，我們的分析表明，當(dāng)考慮患者的生理生物標(biāo)記物而不是診斷因素時(shí)，可以檢測(cè)出統(tǒng)一的，跨疾病的定量微生物組模式。