客戶文章 | 天昊MethylTarget?多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術(shù)在雞膽固醇沉積研究中的應(yīng)用

發(fā)稿時間：2020-05-21來源：天昊生物

 

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動物生理生化重點實驗室和揚州大學(xué)動物科技學(xué)院近期在家禽學(xué)雜志《Poultry Science》上發(fā)表論文，發(fā)現(xiàn)母體甜菜堿的補充可以調(diào)節(jié)SREBP2和CYP7A1基因啟動子DNA甲基化水平，進而降低雞后代的肝膽固醇沉積。本研究采用了MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術(shù)，在恭喜客戶文章發(fā)表的同時，我們也跟大家一起分享下本文的研究思路。英文題目：Maternal betaine supplementation decreases hepatic cholesterol deposition in chicken offspring with epigenetic modulation of SREBP2 and CYP7A1 genes中文題目：母體甜菜堿的補充調(diào)控SREBP2和CYP7A1基因表觀遺傳來降低雞后代肝膽固醇的沉積期刊名：Poultry Science影響因子：2.027發(fā)表時間：2020-4-14

研究摘要

有研究表明，哺乳動物母體中的甜菜堿可以調(diào)控后代的肝膽固醇代謝，然而給蛋雞喂食甜菜堿如何影響后代雞的肝臟膽固醇代謝尚不清楚。本研究給如皋黃羽蛋雞(n = 120)飼喂基礎(chǔ)日糧或添加0.5%甜菜堿的日糧28天，然后收集雞蛋進行孵化。結(jié)果顯示，母雞中的甜菜堿顯著降低子代雞肝臟膽固醇含量。膽固醇生物合成酶、甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白2 (SREBP2)和3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶a還原酶降低，而將膽固醇轉(zhuǎn)化為膽汁酸的膽固醇-7α-羥化酶(CYP7A1)在甜菜堿處理的子代雞中的mRNA和蛋白質(zhì)水平均增加。甜菜堿處理組肝臟低密度脂蛋白受體的mRNA和蛋白表達顯著增加，而介導(dǎo)膽固醇酯化的膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1的mRNA豐度顯著降低。同時，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1和甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶的蛋白含量增加，這與受影響膽固醇代謝基因CpG甲基化的改變有關(guān)。此外，甾醇調(diào)節(jié)因子結(jié)合蛋白2的基因啟動子上的CpG甲基化水平增加，而膽固醇?；D(zhuǎn)移酶1的豐度降低。這些結(jié)果表明，對母雞甜菜堿的補充可以通過對后代幼雞膽固醇代謝基因的表觀遺傳調(diào)節(jié)，顯著降低肝臟膽固醇沉積。

 

研究背景

膽固醇對細胞活力和功能至關(guān)重要，肝臟是膽固醇代謝的主要場所，而膽固醇及其代謝產(chǎn)物水平與雞脂肪肝綜合征疾病有關(guān)，嚴重影響蛋雞的健康和生產(chǎn)效率，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。因此，控制肝臟膽固醇代謝將有益于雞的健康和相關(guān)產(chǎn)業(yè)的預(yù)防策略。

肝臟中膽固醇代謝的體內(nèi)平衡取決于膽固醇生物合成和轉(zhuǎn)化的動態(tài)平衡。SREBP2是激活膽固醇生物合成基因的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，如3-羥基-3-甲基戊二酰-CoA還原酶(HMGCR)。膽固醇可以通過CYP7A1轉(zhuǎn)化為可排泄的膽汁酸而被分解。許多研究表明，SREBP2和CYP7A1是調(diào)節(jié)后代膽固醇代謝的關(guān)鍵因素，以應(yīng)對母體營養(yǎng)干預(yù)。在雞中，探索蛋雞后代中的SREBP2和CYP7A1表達是否易受母體營養(yǎng)狀態(tài)的影響是很有意義的。

甜菜堿是甘氨酸的三甲基衍生物，可直接從飲食中獲得，或通過氧化從飲食膽堿中間接獲得。甜菜堿可以通過一個碳代謝激活DNA甲基化，從而調(diào)節(jié)膽固醇代謝基因的轉(zhuǎn)錄。最近的研究提供了證據(jù)，表明母體甜菜堿暴露增加了肝膽固醇的積累以及CYP7A1基因啟動子的高甲基化。值得注意的是，母雞日糧中添加甜菜堿會引發(fā)后代雞SREBP2和HMGCR基因啟動子的低甲基化，導(dǎo)致下丘腦膽固醇含量升高。本文研究者以前曾報道過，卵內(nèi)注射甜菜堿可通過表觀遺傳基因調(diào)節(jié)來減輕幼年雞體內(nèi)皮質(zhì)酮誘導(dǎo)的肝膽固醇沉積。然而，當(dāng)母雞飼喂甜菜堿時，表觀遺傳修飾是否參與了后代雞肝臟膽固醇代謝基因轉(zhuǎn)錄物的調(diào)節(jié)仍不清楚。

因此，本研究的目的是調(diào)查母雞日糧中添加甜菜堿是否能調(diào)節(jié)子代幼雞的肝臟膽固醇代謝，以及這種影響如何與SREBP2和CYP7A1基因啟動子上的DNA甲基化相關(guān)。

 

材料和方法

將38周齡的120只如皋黃羽母雞隨機分為對照組和甜菜堿組，每組包含60只母雞，在20個籠子里(每個籠子3只母雞)，飼喂基礎(chǔ)日糧(對照)或添加0.5%甜菜堿的日糧(甜菜堿組)，為期4周。記錄初始體重和產(chǎn)蛋能力。在飲食處理后的第18天和第24天對雞進行人工授精。從每組收集200個在飲食處理的最后4天(第25-28天)產(chǎn)下的雞蛋。小雞在保育箱中孵化，一日齡的小雞被單獨稱重。所有的小雞都喂食相同的食物。從孵化到56日齡，每周記錄生長表現(xiàn)。在57日齡時，從每組中選擇30只雄性雞(每組15只)，稱重后處死，采集血樣，分離血漿，并在-20℃下儲存。肝臟(無膽囊)樣品在液氮中快速冷凍，并保持在-80℃下待進一步分析。

之后進行的實驗包括肝臟和血漿的膽固醇含量測定，以及RT-PCR、WB、MeDIP實驗，并采用天昊MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術(shù)，對目的基因啟動子的CpG甲基化進行了亞硫酸氫鹽測序分析。

 

研究結(jié)果

體重、肝臟重量、血清膽固醇和HDL-C濃度、肝臟膽固醇含量母體甜菜堿對后代雞的體重(圖1A)和肝臟重量(圖1B)沒有顯著影響。然而，添加甜菜堿的雞的后代在血漿(圖1C)和肝臟(圖1F)中的膽固醇濃度顯著降低。此外，與對照組相比，補充母體甜菜堿顯著降低了血漿中HDL-C含量(圖1D)。血漿中的LDL-C濃度沒有明顯變化 (圖1E)。

 

圖1、補充母體甜菜堿對仔雞體重、肝臟重量、血漿膽固醇濃度和肝臟總膽固醇含量的影響。

 

膽固醇代謝相關(guān)基因在肝臟中的表達在甜菜堿處理的雞的后代中，甜菜堿引起肝臟膽固醇生物合成基因SREBP2、HMGCR和膽固醇分解代謝基因CYP7A1及ACAT1和LDLR在mRNA(圖2A)和蛋白質(zhì)(圖2B)水平的顯著表達，其他膽固醇代謝基因在基因水平未檢測到顯著變化。

圖2、甜菜堿對幼雞肝臟膽固醇代謝基因表達的影響。

 

蛋氨酸循環(huán)和甲基轉(zhuǎn)移基因的肝蛋白含量在蛋氨酸循環(huán)中涉及的4種酶中，甜菜堿的補充顯著增加甜菜堿同型半胱氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(BHMT)和腺苷同型半胱氨酸酶樣1 (AHCYL1)的肝蛋白含量(圖3A)。此外，甜菜堿處理的后代雞的肝臟中的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1 (DNMT1)的蛋白質(zhì)含量顯著增加(圖3B)。甜菜堿處理雞的后代中，蛋氨酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2B (MAT2B)、甘氨酸N-甲基轉(zhuǎn)移酶(GNMT)和脫氧核糖核酸甲基轉(zhuǎn)移酶3a (DNMT3a)的肝蛋白含量無顯著變化。

圖3、補充母體甜菜堿對碳代謝甲基轉(zhuǎn)移相關(guān)酶類肝蛋白含量的影響。

 

肝臟中SREBP2、CYP7A1和ACAT1基因啟動子的CpG甲基化對從肝臟分離的基因組DNA的MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測序分析顯示，SREBP2、CYP7A1和ACAT1基因啟動子區(qū)的CpG甲基化狀態(tài)受母體甜菜堿喂養(yǎng)的調(diào)節(jié)。對于SREBP2基因啟動子，分析了CpG島的兩個區(qū)域(圖4A)。片段1跨越翻譯起始密碼子ATG上游-2030到-1612，包含13個CpG位點，而片段2跨越-3384到-2987，包含12個CpG位點。與對照組相比，甜菜堿組片段1上的7個CpG位點顯著高甲基化，片段2上的9個CpG位點顯著高甲基化，而片段2上的2個CpG位點為低甲基化 (圖4B、4C)。同時，MeDIP結(jié)果證實，在甜菜堿處理的雞的后代中，SREBP2啟動子顯著高甲基化(圖4D)。

圖4、肝臟中SREBP2基因啟動子的甲基化狀態(tài)。

 

對CYP7A1基因啟動子分析了1個片段(圖5A)。該片段位于翻譯起始密碼子ATG的上游-282到-53，包含7個CpG位點。在甜菜堿組中，在CYP7A1基因啟動子上檢測到的7個CpG位點中有6個是低甲基化(圖5B)。MeDIP結(jié)果顯示，在甜菜堿處理的雞的后代中，CYP7A1啟動子顯著地低甲基化 (圖5C)。

圖5、肝臟中CYP7A1基因啟動子的甲基化狀態(tài)。

 

對ACAT1基因啟動子分析了1個片段(圖6A)。該片段位于翻譯起始密碼子ATG的上游-483到-269，包含19個CpG位點。在ACAT1基因啟動子上檢測到的19個CpG位點中有7個是高甲基化，在甜菜堿組中19個CpG位點中有1個是低甲基化的(圖6B)。MeDIP結(jié)果顯示，在甜菜堿組中，ACAT1基因啟動子顯著高甲基化(圖4C)。

圖6、肝臟中ACAT1基因啟動子的甲基化狀態(tài)。

 

總的來說，在所有檢測到的片段中，SREBP2、CYP7A1和ACAT1基因啟動子的平均甲基化率分別與它們的mRNA豐度成反比。

 

研究結(jié)論

本研究證明了母體甜菜堿的補充可以改變對膽固醇代謝基因的表觀遺傳，進而降低子代幼雞肝臟中的膽固醇含量。

昊技術(shù)

天昊MethylTarget^?多重目的區(qū)域甲基化富集測序技術(shù)：

§  性價比高：傳統(tǒng)克隆測序一個片段10個克隆的價格，MethylTarget可以完成約60個片段的檢測（檢測深度為1000X，相當(dāng)于1000個克?。?。

§  精確度高：基于二代測序數(shù)據(jù)檢測甲基化程度，精確到單堿基分辨率，與基于測序的全基因組甲基化測序，RRBS數(shù)據(jù)有高度一致性。

§  精確定量：測序深度高達1000X，并可以進一步加深，相比于傳統(tǒng)克隆測序，可以對位點甲基化程度進行準確定量。

§  技術(shù)靈活：基于多重PCR富集進行目標區(qū)域富集，可隨時進行基因和位點的變化和改動，并且可以獲得每個片段的甲基化單倍型。

 

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