客戶文章|天昊iMLDR?多重SNP分型技術(shù)助力湖羊睪丸發(fā)育遺傳研究

發(fā)稿時(shí)間：2020-05-08來源：客戶文章|天昊iMLDR?多重SNP分型技術(shù)助力湖羊睪丸發(fā)育遺傳研究

蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院樂祥鵬老師課題組近期在動(dòng)物遺傳育種雜志《Animals》上發(fā)表論文，發(fā)現(xiàn)DAZL基因中兩個(gè)SNPs與湖羊睪丸重量變異系數(shù)顯著相關(guān)，可作為早期公羊選擇重要指標(biāo)。本研究采用了天昊生物iMLDR^?多重SNP分型技術(shù)，在恭喜客戶文章發(fā)表的同時(shí)，我們也跟大家一起分享下本文的研究思路。

英文題目：Expression of DAZL Gene in Selected Tissues and Association of Its Polymorphisms with Testicular Size in Hu Sheep

中文題目：湖羊DAZL基因在特定組織中的表達(dá)及其多態(tài)性與睪丸大小的關(guān)聯(lián)

期刊名：Animals

影響因子： 1.832

發(fā)表時(shí)間：2020-4-23

研究摘要

一種編碼RNA結(jié)合蛋白的無精癥樣缺失(Deleted in Azoospermia-Like, DAZL)基因在許多物種的配子體發(fā)生中起著關(guān)鍵作用，也是減數(shù)分裂前的標(biāo)志物。本研究采用qPCR、DNA混池測(cè)序、天昊生物iMLDR^?多重SNP分型技術(shù)和RFLP方法，檢測(cè)了綿羊DAZL基因的表達(dá)和SNPs。結(jié)果證實(shí)，綿羊在六個(gè)月大的時(shí)候，DAZL在五個(gè)發(fā)育階段表現(xiàn)出最高的表達(dá)水平。在6個(gè)月的階段對(duì)7個(gè)組織的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，DAZL主要在的睪丸中的表達(dá)。盡管不夠顯著，但DAZL在大睪丸組中的表達(dá)高于小睪丸組。此外，在DAZL發(fā)現(xiàn)了六個(gè)SNPs (SNP1-SNP6)。其中，SNP1 (p < 0.05)和SNP6 (p < 0.01)與左右附睪重量變異系數(shù)(VCTW)顯著相關(guān)。目前的研究表明，DAZL可能在睪丸發(fā)育中發(fā)揮重要作用，其SNPs與睪丸參數(shù)相關(guān)，為早期公羊選擇提供重要指標(biāo)。

研究背景

人工授精在動(dòng)物生產(chǎn)中已廣泛應(yīng)用，精液質(zhì)量高的雄性有助于加速基因改良。養(yǎng)羊業(yè)選擇高繁殖力的優(yōu)良公羊是非常重要的。傳統(tǒng)上，精液的數(shù)量和質(zhì)量是評(píng)價(jià)公羊繁殖力的重要指標(biāo)，但它具有較低的可遺傳性。以前的研究發(fā)現(xiàn)，睪丸大小與射精量、精子活力和精子密度呈正相關(guān)，與精子形態(tài)異常呈負(fù)相關(guān)。此外，睪丸大小易于測(cè)量并具有高遺傳力，這表明它是選擇具有高繁殖力的候選公羊的一個(gè)極好的指標(biāo)。因此，篩選與睪丸發(fā)育相關(guān)的重要候選基因的遺傳變異有助于早期選擇優(yōu)良公羊。
無精子癥缺失(DAZ)家族是一類RNA結(jié)合蛋白，它在精子發(fā)生、配子發(fā)生和出生后雄性生殖細(xì)胞發(fā)育中起重要作用。該家族由三個(gè)成員組成，包括一個(gè)Y染色體DAZ基因和兩個(gè)常染色體同源基因：無精癥樣缺失(DAZL)基因和boule樣RNA結(jié)合蛋白(BOLL，也稱為BOULE) 基因。在人類中，DAZL的SNPs已被發(fā)現(xiàn)對(duì)中國(guó)人口的男性生育力有顯著影響。
本研究檢測(cè)了DAZL在湖羊心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌和睪丸中的表達(dá)模式，并比較了其在新生期、青春期、性成熟期、體成熟期和成年期睪丸中的表達(dá)。此外，還應(yīng)用了DNA混池測(cè)序、iMLDR?多重SNP分型技術(shù)和RFLP方法來篩選DAZL中與睪丸大小和相關(guān)性狀相關(guān)的SNPs。本研究旨在為湖羊動(dòng)物育種提供理論和實(shí)踐意義，并為湖羊早期標(biāo)記輔助選擇提供分子標(biāo)記。

材料和方法

本研究選取352只出生體重相近、出生年齡相近、無隱睪的健康雄性湖羊羔羊。將該群體分為5組，分別為0天、3個(gè)月、6個(gè)月、12個(gè)月和24個(gè)月屠宰的M0(新生期，n = 3)、M3(青春期，n = 3)、M6(性成熟，n = 340)、M12(身體成熟，n = 3)和M24(成年，n = 3)。屠宰后，測(cè)量睪丸和附睪的重量和體積，并立即采集睪丸和附睪樣品。此外，在所有M6個(gè)體中選擇3只接近平均睪丸重量的湖羊，采集心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟和背最長(zhǎng)肌的樣本。分別提取DNA和總RNA，進(jìn)行后續(xù)qPCR、RFLP和iMLDR^?多重SNP基因分型，為了驗(yàn)證iMLDR^?的準(zhǔn)確性，檢測(cè)包含2個(gè)ddH₂O在內(nèi)的6個(gè)隨機(jī)重復(fù)雙盲樣品。

研究結(jié)果

3.1、DAZL在不同生長(zhǎng)階段睪丸中的表達(dá)

通過qPCR檢測(cè)不同生長(zhǎng)階段(M0、M3、M6 M12和M24)睪丸中的DAZL表達(dá)。通過Kruskal–Wallis秩和檢驗(yàn)對(duì)五個(gè)生長(zhǎng)階段的基因豐度進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示DAZL在M6的表達(dá)最高(圖1)。

圖1、睪丸發(fā)育過程中DAZL基因的表達(dá)水平。

3.2、DAZL在M6不同組織和不同大小睪丸中的表達(dá)

DAZL在這個(gè)階段顯示出最高的表達(dá)水平，因此對(duì)DAZL的基因表達(dá)水平在M6的不同組織和不同大小的睪丸中進(jìn)行了進(jìn)一步分析。選取湖羊的心、肝、脾、肺、腎、背最長(zhǎng)肌和睪丸，以及最大(L)和最小(S)睪丸。表達(dá)結(jié)果顯示，DAZL在睪丸中表達(dá)極高，顯著高于在腎臟中的表達(dá)(圖2A)。DAZL在大睪丸組的表達(dá)高于小睪丸組，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異(p = 0.34) (圖2B)。

圖2、DAZL在6月齡(M6)不同組織和不同大小睪丸組中的表達(dá)水平。

3.3、SNP檢測(cè)和基因分型

在這項(xiàng)研究中，通過DNA混池測(cè)序共檢測(cè)到6個(gè)SNPs (表2)。

表2、檢測(cè)到的單核苷酸多態(tài)性的位置和突變類型

SNP1-SNP5可以通過iMLDR^?方法進(jìn)行基因分型，而SNP6可以通過限制性內(nèi)切酶AluI (A^GCT)識(shí)別并通過PCR-RFLP進(jìn)行基因分型。在SNP6中觀察到三種基因型：GG型、GA型和AA型。在SNP6基因座中，GG基因型在瓊脂糖凝膠電泳中顯示159 bp的條帶。雜合子遺傳型顯示了159 bp、92 bp和67 bp的三個(gè)條帶。AA基因型顯示了92 bp和67 bp的兩條條帶(圖3)。

圖3、DAZL的SNP6基因座三種基因型的瓊脂糖凝膠電泳。

所有6個(gè)單核苷酸多態(tài)性都成功地進(jìn)行了基因分型，基因型和等位基因頻率等見表2。除了SNP2外，其余SNPs顯示出中度多態(tài)性。

表3、DAZL的SNPs基因型和等位基因頻率、預(yù)期雜合度(He)、有效等位基因數(shù)(Ne)、多態(tài)性信息含量(PIC)、哈迪-溫伯格平衡(HWE)檢驗(yàn)p值。

3.4、SNPs與睪丸大小參數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

Shapiro檢驗(yàn)的結(jié)果表明，所有的表型都偏離了常態(tài)。為了使表型盡可能地服從正態(tài)分布，用sqrt()轉(zhuǎn)換非比率變量，用asin(sqrt())轉(zhuǎn)換比率變量。采用方差分析和非參數(shù)方法進(jìn)行SNPs關(guān)聯(lián)分析。結(jié)果表明兩種統(tǒng)計(jì)方法具有一致的結(jié)果(表4)。SNP1對(duì)左右附睪重量的變異系數(shù)有顯著影響(VCEW, p < 0.05)，SNP6與VCEW有極強(qiáng)的相關(guān)性(p < 0.01)。其余的SNPs對(duì)睪丸參數(shù)沒有顯著影響(表4)。

表4、DAZL的SNPs與睪丸性狀的關(guān)聯(lián)分析。

3.5、連鎖不平衡分析

利用HAPLOVIEW軟件對(duì)DAZL鑒定的6個(gè)SNPs之間的連鎖不平衡進(jìn)行分析，結(jié)果顯示，除了SNP2與SNP1和SNP6未顯示強(qiáng)連鎖外，其余的SNPs都為強(qiáng)連鎖不平衡 (圖4)。

圖4、6個(gè)SNPs的連鎖不平衡分析。

此外，還獲得5種單倍型。TTCGGG是頻率最高的單倍型，為0.537，CTTAAA次之，為0.224，TTTAAG、TGCAAG和CTTAAG分別為0.189、0.027和0.014。

此外還分析了6個(gè)SNPs的基因單倍型。總共有4個(gè)單倍型(CTTTCTGAGAGAGA、CTTTTTAAAAGA、TTTTTTCCGGGGGG和TTTTCTGAGAGG)用于該群體的進(jìn)一步分析(表5)。結(jié)果表明，不同單體型間的變異系數(shù)差異顯著(表5)。CTTTCTGAGAGA單倍型的VCEW顯著高于TTTTCCGGGGGG和TTTTCTGAGAGG單倍型。

表5、不同單體型與睪丸性狀的關(guān)聯(lián)分析。

研究結(jié)論

在本研究中，研究者對(duì)湖羊DAZL的表達(dá)進(jìn)行了研究，揭示了主要在睪丸中表達(dá)，并且在6個(gè)月時(shí)大睪丸比小睪丸具有更豐富的表達(dá)。此外，DAZL的表達(dá)水平在睪丸發(fā)育的6個(gè)月達(dá)到高峰。在DAZL共發(fā)現(xiàn)6個(gè)SNPs，其中SNP1和SNP6對(duì)左右附睪重量的變異系數(shù)有顯著影響。這些發(fā)現(xiàn)表明，DAZL在睪丸發(fā)育過程中至關(guān)重要，其與睪丸參數(shù)相關(guān)的SNPs可為早期公羊選擇提供重要指標(biāo)。

昊技術(shù)：