染色質(zhì)可及性分析揭示人視網(wǎng)膜的調(diào)控動態(tài)

發(fā)稿時間：2020-04-26來源：天昊生物

 

2020年2月Science Advances雜志一篇研究報道了中國科學(xué)技術(shù)大學(xué)生命科學(xué)與醫(yī)學(xué)部生命科學(xué)學(xué)院薛天教授課題組與瞿昆教授課題組利用ATAC-seq等多組學(xué)技術(shù)分析了發(fā)育中的人視網(wǎng)膜及hiPSC誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜類器官（retinal organoids, ROs）的染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄調(diào)控動態(tài)過程。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)ROs在很大程度上可以模擬人類視網(wǎng)膜生成，從中也發(fā)現(xiàn)了人和小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中不同的染色質(zhì)特征，并進一步重建了調(diào)控人與RO視網(wǎng)膜發(fā)生的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

 

研究背景

視網(wǎng)膜由多種類型的神經(jīng)元(光感受器、水平細胞、雙極細胞、無長突細胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞)及從視網(wǎng)膜祖細胞（RPCs）分化的單一類型的神經(jīng)膠質(zhì)細胞(M?ller細胞)組成，視網(wǎng)膜是研究CNS中神經(jīng)發(fā)生調(diào)控一個很好的系統(tǒng)。在破譯嚙齒類動物視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生的復(fù)雜分子機制方面已經(jīng)取得了巨大的進展。相比之下，關(guān)于人類視網(wǎng)膜發(fā)生的分子機制的知識仍然匱乏。人類視網(wǎng)膜研究的最新進展為發(fā)育中的人類視網(wǎng)膜提供了有價值的基因表達和表觀遺傳信息。然而，轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的分析可以深入了解相互作用的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)的調(diào)控，但在人類視網(wǎng)膜發(fā)育過程中仍知之甚少。

轉(zhuǎn)座酶可接近的染色質(zhì)高通量測序技術(shù)(ATAC-seq)已成為一種靈敏且可靠的方法，可用于開放染色質(zhì)檢測、核小體位點定位和TF占據(jù)的分析。此外，ATAC-seq也適用于發(fā)育過程中轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，因為將已知的TF模體(motif)與ATAC-seq的染色質(zhì)可及性數(shù)據(jù)整合可以預(yù)測全基因組范圍內(nèi)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。因此，系統(tǒng)的ATAC-seq分析將是解讀人類視網(wǎng)膜發(fā)育過程中表觀遺傳特征和轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的有力工具。

染色質(zhì)可及性的動態(tài)在調(diào)節(jié)人類發(fā)育中起著重要的作用，包括細胞命運的決定、細胞分化和疾病的發(fā)生。最近的研究表明，在小鼠的命運決定過程中，視桿和視錐光感受器顯示出明顯不同的染色質(zhì)可及性，這表明細胞表觀基因組狀態(tài)對視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生至關(guān)重要。在本研究中，研究人員使用ATAC-seq和RNA-seq，探索人類視網(wǎng)膜和ROs在長期視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的染色質(zhì)可及性和轉(zhuǎn)錄變化。

 

主要研究結(jié)果

一、發(fā)育中的人視網(wǎng)膜和ROs染色質(zhì)可及性圖譜

為了確定發(fā)育中的人視網(wǎng)膜和ROs的染色質(zhì)可及性，收集了妊娠第6周——25周9個時間點的發(fā)育中的人視網(wǎng)膜樣本（GW6, GW10, GW11, GW12, GW14, GW15, GW20, GW24, GW25; 其中GW11, GW15, GW20, GW24, GW25各2個生物學(xué)重復(fù); GW6, GW10, GW12, GW14各1個生物學(xué)重復(fù)，這些妊娠周期橫跨了人視網(wǎng)膜發(fā)育的關(guān)鍵階段），并收集了0周——30周hiPSC誘導(dǎo)的ROs（w0, w2, w4, w6, w10, w15, w23, w30，各2個生物學(xué)重復(fù)）用于ATAC-seq分析（圖1A）。同時對w0, w2, w6, w10, w15和w23 ROs（n = 1）進行RNA-seq，而發(fā)育中的人視網(wǎng)膜RNA-seq數(shù)據(jù)由先前的研究獲得。對發(fā)育中的人視網(wǎng)膜和ROs中RCVRN和NR2E3進行染色，作為RPCs向光感受器分化的標(biāo)記（圖1B、C）。數(shù)據(jù)顯示，RCVRN蛋白分別在人視網(wǎng)膜GW14和ROs w10時開始表達，一直持續(xù)到GW25和w30。與RCVRN類似，視桿光感受器標(biāo)志物NR2E3分別在GW20和w15時顯現(xiàn)。光感受器標(biāo)志物的相近的表達趨勢表明，RO培養(yǎng)表現(xiàn)出漸進的視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生，就像在人類視網(wǎng)膜中發(fā)現(xiàn)的一樣。

圖1A-D發(fā)育中的人視網(wǎng)膜和RO的染色質(zhì)可及性圖譜

對ATAC-seq peak信號強度的相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)人視網(wǎng)膜和ROs間染色質(zhì)可及性的相似性（圖1D）。樣本的重復(fù)高度聚集在一起，證實了實驗高的重復(fù)性。除了w0（未分化hiPSCs），整個的視網(wǎng)膜發(fā)育過程可以分成3個時期，即早期（GW6; w2 to w6），中期（GW10 to GW14; w10 to w15）和末期（GW15 to GW25; w23 to w30），表明人視網(wǎng)膜和ROs的發(fā)育在染色質(zhì)可及性上是相關(guān)的（圖1D）。主成分分析(PCA)顯示，人視網(wǎng)膜和ROs的發(fā)育軌跡在時間上呈二維相關(guān)（圖1E）。

進一步研究染色質(zhì)可及性是否與基因表達變化相關(guān)。作為陽性對照，發(fā)現(xiàn)在RCVRN基因推斷的啟動子和增強子位點ATAC-seq和DHS-seq信號富集的增加，與該階段基因表達一致（圖1F、G）。此外，對ROs發(fā)育過程中RCVRN表達水平進行qRT-PCR定量，結(jié)果驗證了ATAC-seq數(shù)據(jù)中RCVRN表達的富集與染色質(zhì)動態(tài)之間的一致性（圖1H）?？傮w而言，這些數(shù)據(jù)表明RO分化在很大程度上能反映人類視網(wǎng)膜的發(fā)育過程。基于發(fā)育中的人視網(wǎng)膜和ROs的染色質(zhì)可及性，本研究建立了人視網(wǎng)膜和ROs之間的時間相關(guān)性圖譜。

圖1E-H 發(fā)育中的人視網(wǎng)膜和RO的染色質(zhì)可及性圖譜

 

二、染色質(zhì)可及性反映了人視網(wǎng)膜和ROs的發(fā)育變化

為了闡明表觀基因組動態(tài)是如何控制人類視網(wǎng)膜發(fā)育的，對人類視網(wǎng)膜和ROs在不同發(fā)育時間點的ATAC-seq信號進行了兩兩比較。在基因組中發(fā)現(xiàn)了10563個差異的DNA可接近位點(來自人類視網(wǎng)膜的8805個和來自ROs的10160個)，并通過無監(jiān)督的層次聚類確定了5種不同的調(diào)控元件簇(C1到C5，圖2A)。為了理解這些顯著差peaks的功能，應(yīng)用了GREAT v3.0.0進行GO富集分析。GO分析顯示C4中的peaks主要富集在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，包括神經(jīng)發(fā)生(P < 1 × 10^–60)和神經(jīng)元分化(P < 1 × 10^–42，圖2B)，表明其在視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生中的關(guān)鍵作用。C5中的peaks在人視網(wǎng)膜和ROs發(fā)育開始階段并不具有可及性，而是在發(fā)育末期逐漸形成(GW15 to GW25, w10 to w30)。C5組包括2624個peaks，富集在光刺激的感覺(P < 1 × 10^–8)、視覺感知(P < 1 × 10^–7)和光感受器細胞分化(P < 1 × 10^–6)，這表示人視網(wǎng)膜功能的成熟，特別是光感受器(圖2C)。因此，這三個功能組(另一個功能組包括C1和C2)的GO條目代表了視網(wǎng)膜形成的順序性，而染色質(zhì)可及性的分類為定義視網(wǎng)膜和RO發(fā)育過程中關(guān)鍵發(fā)育事件的時間提供了可能性。

為了進一步比較視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的人類視網(wǎng)膜和RO轉(zhuǎn)錄組，對來自人類視網(wǎng)膜的3235個差異表達基因(DEGs)進行了開放式動態(tài)時間規(guī)整(OE-DTW)分析(圖2D)。結(jié)果觀察到人類視網(wǎng)膜(GW7至GW20)和ROs (w0至w23)之間存在緊密的時間相關(guān)性，這證實了人類視網(wǎng)膜和ROs在基因表達變化上具有相當(dāng)多的相似性。接下來分析不同簇(C1到C5)中的染色質(zhì)特征是否與相應(yīng)的基因表達相關(guān)。研究選擇每個簇的前1000個峰，然后應(yīng)用GREAT依據(jù)ATAC-seq峰和相關(guān)的基因表達值獲得一個基因列表。結(jié)合視網(wǎng)膜發(fā)育過程中的ATAC-seq與RNA-seq數(shù)據(jù)，那些在臨近位點獲得染色質(zhì)可及性的基因其表達水平也明顯增加，而基因位點附近失去了染色質(zhì)可及性的基因則表現(xiàn)出表達的降低(圖2E-H)，表明表觀遺傳和RNA分析之間具有高度的相關(guān)性。

圖2 發(fā)育中的人視網(wǎng)膜和RO的表觀遺傳特征及表達譜

三、發(fā)現(xiàn)潛在的TFs參與人視網(wǎng)膜發(fā)育

從C4和C5 ATAC-seq峰中富集的TFs分別被發(fā)現(xiàn)是神經(jīng)元和感光細胞分化的關(guān)鍵調(diào)控因子(圖3A、B)。例如，cluster C4中富集了VSX2、SMAD2和NEUROD1，它們對視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生具有重要作用。C5富含OTX2、CRX和NR2E3，它們是光感受器分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。RPC分化和細胞命運決定需要OTX2。CRX是光感受器生存和分化的關(guān)鍵調(diào)控因子。NR2E3是NRL參與嚙齒動物視桿細胞和視錐細胞光感受器分化的直接靶點。因此，ATAC-seq數(shù)據(jù)預(yù)測的TFs與視網(wǎng)膜形成和分化高度相關(guān)。

由于C4和C5 peaks與視網(wǎng)膜發(fā)育的中期和后期有關(guān)，這對神經(jīng)發(fā)生和光傳導(dǎo)非常重要，因此重點研究了C4和C5，以尋找以前未知的神經(jīng)發(fā)生調(diào)控因子。僅使用motif分析預(yù)測TF的一個注意事項是TFs或TF家族可以共享相同的motif；因此，通過整合ATAC-seq數(shù)據(jù)的motif富集分析和RNA-seq數(shù)據(jù)的基因表達分析，以更好地預(yù)測C4和C5可接近位點上TF的占據(jù)情況。在每個時間點，在同一張圖中繪制表達值和motif富集分?jǐn)?shù)(圖3 C)，數(shù)據(jù)顯示許多已知的光感受器發(fā)育TFs呈高表達，其motifs富集在中、晚期(GW10到GW20，w10到w23)，包括CRX、OTX2、ASCL1和NR2E1。

為了進一步完善對視網(wǎng)膜發(fā)育潛在調(diào)控因子的預(yù)測，對ATAC-seq數(shù)據(jù)進行了TF印記分析，該分析為基因組DNA上TF候選因子直接占據(jù)提供了證據(jù)。DNA序列直接被DNA結(jié)合蛋白所占據(jù)，在ATAC-seq文庫構(gòu)建期間不受轉(zhuǎn)座酶的影響，因此，產(chǎn)生的序列印記能夠顯示在其結(jié)合位點存在DNA結(jié)合蛋白，類似于DNA酶消化的印記。研究繪制了兩種已知的調(diào)節(jié)因子ASCL1和CRX的印記，觀察到他們在人類視網(wǎng)膜和RO發(fā)育的晚期比早期具有更深的印記，在motif側(cè)翼具有更高的DNA可及性(圖3D)。值得注意的是，NFIB和THRA在晚期印記更深，更易接近，表明這兩個TFs的motif不僅富集在階段特異性的peaks，而且更可能物理性結(jié)合到染色質(zhì)可接近的位點，說明他們是人視網(wǎng)膜和RO發(fā)育的可能的功能調(diào)控因子?？偟膩碚f，正交印跡結(jié)果與motif富集結(jié)果一致，這表明NFIB和THRA是潛在的先前未被識別的視網(wǎng)膜發(fā)育調(diào)節(jié)因子。

圖3 發(fā)育中的人視網(wǎng)膜和RO的TF占據(jù)

 

四、NFIB和THRA調(diào)控視網(wǎng)膜發(fā)生相關(guān)基因的表達

由于ROs在基因表達和染色質(zhì)可及性方面與人類視網(wǎng)膜相似，該研究以ROs為模型，探討NFIB和THRA在視網(wǎng)膜發(fā)育中的潛在作用。首先建立了一種電穿孔的方法來有效地過表達或敲降ROs中的靶基因。ROs中明亮的視網(wǎng)膜神經(jīng)上皮的外層被切成直徑約500μm的小塊，放入比色皿中進行電穿孔(圖4A)。收集電穿孔后第10天的RO樣品進行qRT-PCR或RNA-seq分析(圖4B)。研究CRX、NFIB和THRA三個基因在視網(wǎng)膜發(fā)育中的作用。作為陽性對照，并測試該電穿孔系統(tǒng)，CRX在約w14的ROs中被敲降，在w7周被過表達。因此這些結(jié)果表明本研究建立了一個可靠的ROs基因操作系統(tǒng)。接下來，NFIB或THRA敲降的特異性短發(fā)夾RNA (shRNA)載體在~w14經(jīng)電穿孔進ROs，這是NFIB和THRA表達的時間點。通過qRT-PCR或RNA-seq分析發(fā)現(xiàn)了NFIB和THRA的表達顯著降低(圖4C)。為了驗證這兩種TFs的功能性敲低，接下來分析了NFIB和ARNTL的已知靶點，THRA潛在靶點EZH2的表達水平。結(jié)果顯示，由于NFIB和THRA的缺失，EZH2和ARNTL的表達量分別顯著下降(圖4C)。值得注意的是，發(fā)現(xiàn)在NFIB和THRA的敲低下，一些光感受器相關(guān)的基因(CRX、RHO和GNAT1)被下調(diào)，這表明NFIB和THRA可能參與了光感受器分化的調(diào)控(圖4C、D)。NFIB在胎兒大腦皮層神經(jīng)祖細胞和膠質(zhì)細胞中高度表達，是胎兒大腦皮層神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞分化所必需的?？紤]到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)發(fā)生調(diào)節(jié)是保守的，選擇NFIB進行進一步的功能研究。NFIB敲低(NFIB_KD) ROs的RNA-seq顯示許多下調(diào)的視網(wǎng)膜發(fā)生基因，包括GNAT1、NR2E3和GNGT2(圖4D)。GO分析NFIB_KD RNA-seq下調(diào)和上調(diào)基因強烈表明NFIB對視網(wǎng)膜發(fā)育是需要的，特別是對光感受器分化(圖4E、F)。此外,進一步利用免疫組織化學(xué)檢測NFIB_KD對w14和15間高表達的光感受器相關(guān)蛋白RCVRN的影響 (圖4G)。RCVRN相對強度的定量結(jié)果表明，NFIB_KD降低了RCVRN的蛋白表達(圖4H)。同樣地，RCVRN陽性細胞在NFIB_KD ROs中的比例也相應(yīng)降低(圖4I)?？傊?，這些數(shù)據(jù)表明NFIB和THRA參與了人類視網(wǎng)膜和RO的發(fā)育過程?？赡苁?span>NFIB和THRA影響了RPC到光感受器和M?ller細胞的自我更新和分化能力。然而，這一假設(shè)還需要進一步研究。

圖4 NFIB和THRA對于視網(wǎng)膜分化是必需的

 

五、人視網(wǎng)膜發(fā)育期間TF調(diào)控網(wǎng)絡(luò)預(yù)測

TFs通常通過相互間的交互作用來調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。為了建立富集的TFs的潛在聯(lián)系，本研究重建了人視網(wǎng)膜和RO發(fā)育過程中TF調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)的全局圖像。首先，使用HOMER v4.8來識別與C1到C5 peaks相結(jié)合的富集的TFs (P < 1 × 10^–20)。將TFs之間的連接(邊)定義為：如果TF-X的motif位于TF-Y的啟動子上，則TF-X調(diào)節(jié)TF-Y，從而畫箭頭由TF-X指向TF-Y。在這里，只考慮在這個時間點明確表達的TFs。這條規(guī)則的基礎(chǔ)上，分別構(gòu)建了早、中、晚期人類視網(wǎng)膜(GW6, GW10, GW20)和ROs(w6, w10和w23)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)(圖5A、B)。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)在不同的時間點呈高度動態(tài)變化。NFIB和THRA也富集在晚期TF網(wǎng)絡(luò)中并與其他TFs相聯(lián)系，參與到視網(wǎng)膜發(fā)育(圖5A、B)。為了更好地呈現(xiàn)TFs在網(wǎng)絡(luò)中的重要性，定義網(wǎng)絡(luò)中每個節(jié)點的連接分?jǐn)?shù)為邊數(shù)乘以其表達的SD值(圖5C、D)。例如，TFs具有靠前的連接分?jǐn)?shù)，如VSX2、NR2E3和CRX，作為眾所周知的視網(wǎng)膜發(fā)育調(diào)控因子。從人類視網(wǎng)膜和ROs的TF網(wǎng)絡(luò)在早期和晚期發(fā)育的時間點上呈高度相關(guān)(圖5E)。然而，TF網(wǎng)絡(luò)在中期相關(guān)性相對較低，這可能是由于人類視網(wǎng)膜和ROs之間存在不同的C4染色質(zhì)可及性(圖2A)。

圖5 發(fā)育中的人視網(wǎng)膜和RO的動態(tài)轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

 

六、人和小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育中不同的組蛋白修飾

對人ATAC-seq或小鼠DHS-seq數(shù)據(jù)聯(lián)合AlDiri等人研究的視網(wǎng)膜發(fā)育的ChIP-seq數(shù)據(jù)進行分析。11個染色質(zhì)隱馬爾可夫模型(chromHMM)狀態(tài)被復(fù)制用于系統(tǒng)地注釋從C1到C5 (C3除外)以及從MC2到MC5區(qū)域視網(wǎng)膜形成過程中的表觀遺傳狀態(tài)(圖6A、B)。狀態(tài)1具有活躍的表觀遺傳標(biāo)記，狀態(tài)2和3主要是增強子，狀態(tài)4是二價啟動子。狀態(tài)5被定義為PolII結(jié)合，狀態(tài)6和7與基因體一致(H3K36me3)。狀態(tài)8是啟動子或增強子外的一個多梳抑制的染色質(zhì)(H3K27me3)。狀態(tài)9為空染色質(zhì)，狀態(tài)10為H3K9me3抑制的染色質(zhì)。狀態(tài)11由絕緣體蛋白CCCTC-結(jié)合因子(CTCF)所標(biāo)記。

二價修飾(狀態(tài)4)在人類視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生中特異性地標(biāo)記C4峰區(qū)，而在小鼠MC4中沒有。為了清楚地展示人類和小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育過程中不同組蛋白修飾的動態(tài)變化，研究計算了每個cluster組蛋白修飾的信號(圖6C、D)。H3K4me3和H3K27me3的組蛋白修飾信號在C4開放區(qū)域富集。然而，在小鼠MC4中沒有這種顯著的雙價修飾。這些數(shù)據(jù)表明，在視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生過程中，H3K4me3和H3K27me3的二價修飾在人和小鼠之間是有區(qū)別的，這表明，由于這些組蛋白修飾在基因組上的協(xié)同作用，發(fā)育中的人類視網(wǎng)膜比小鼠具有更專門的表觀遺傳調(diào)控。

接下來，根據(jù)峰區(qū)不同組蛋白修飾的富集情況，將C4分為兩亞組，即二價亞組(H3K4me3和H3K27me3)和僅有H3K4me3 (H3K4me3-only)的亞組(圖6E)。GO分析發(fā)現(xiàn)，二價亞組與器官發(fā)育、神經(jīng)元生成和發(fā)育過程顯著相關(guān)，提示二價性在神經(jīng)發(fā)生中起重要作用。只有H3K4me3的亞組富含磷酸化和鳥苷三磷酸酶(GTPase)介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與一般的生物學(xué)過程。正如預(yù)期的那樣，研究觀察到H3K4me3-only富集在瘋狂表達的基因PDK2，其功能上作為機械傳導(dǎo)刺激增加細胞內(nèi)鈣對流體流動的反應(yīng)，而二價H3K4me3和H3K27me3結(jié)構(gòu)域在發(fā)育基因BMP8B上被檢測到。H3K4me1是神經(jīng)發(fā)生的關(guān)鍵修飾之一。與此一致，C4二價亞群的H3K4me1信號多于C4 H3K4me3-only亞群(圖6F)，進一步證實了C4二價亞群在神經(jīng)發(fā)生中的關(guān)鍵作用。利用motif分析，預(yù)測了利用雙價域調(diào)控motif的TFs(圖6G)。已知的發(fā)育性TFs (OTX2/CRX)和增殖性TFs (c-Myc)在二價亞群中富集，它們對視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生的各種調(diào)控至關(guān)重要。由于已經(jīng)確定了NFIB和THRA在視網(wǎng)膜發(fā)育中的作用，進一步研究了它們的染色質(zhì)區(qū)域周圍的組蛋白修飾(圖6H)。與預(yù)期一樣，NFIB和THRA被H3K4me3和H3K27me3雙價修飾，進一步證實這些因素與視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生有關(guān)?？傊?，C4中的二價組蛋白修飾與人類視網(wǎng)膜神經(jīng)發(fā)生高度相關(guān)，但在小鼠中相對較弱或缺失。

圖6 人、鼠視網(wǎng)膜發(fā)育的交叉表觀遺傳學(xué)分析

 

總結(jié)

總之，本研究提供了全面的伴隨人類視網(wǎng)膜和RO發(fā)育的染色質(zhì)圖譜，建立了人類視網(wǎng)膜和RO發(fā)育之間的時間和分子相關(guān)性的綜合資源，發(fā)現(xiàn)了TFs對人類視網(wǎng)膜發(fā)育的影響，并重建了轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和信號通路，極大地拓展了我們對人類視網(wǎng)膜發(fā)育的認識，為下一步的研究提供了路線圖。