染色質可及性檢測方法綜述

發(fā)稿時間：2020-04-17來源：天昊生物

染色質可及性(Chromatin accessibility)是指核大分子能夠與染色質化的DNA進行物理接觸的程度，由核小體及其他阻礙接近DNA的染色質結合因子的占據(jù)和拓撲結構所決定。核小體是染色質的核心結構元件，由一個組蛋白八聚體組成，周圍環(huán)繞著約147 bp的DNA。核小體的組成和翻譯后修飾反映了不同的功能狀態(tài)，并通過多種機制調(diào)節(jié)染色質的可及性，如通過空間位阻改變轉錄因子(TF)結合，調(diào)節(jié)核小體對活性染色質重塑因子(remodellers)的親和力。基因組中核小體的拓撲結構是不一致的：雖然在兼性和組成性異染色質內(nèi)密集排列，但組蛋白在調(diào)節(jié)位點(包括增強子、絕緣子和轉錄的基因體內(nèi))是缺失的。核小體間DNA常與TFs、RNA聚合酶或具有連接組蛋白(linker histones)的結構蛋白結合，這有助于高級染色質的結構并調(diào)控對DNA的接近。核小體占據(jù)和連接組蛋白占據(jù)在基因組范圍內(nèi)呈動態(tài)變化，構建了一個從封閉染色質到高度動態(tài)，可接近或開放染色質的可及性連續(xù)體 (圖1)。染色質可及性圖譜廣泛反映了調(diào)控的能力，并不是一個靜態(tài)的生物物理狀態(tài)，其對染色質的結構和功能至關重要。

圖1 可及性狀態(tài)反映了染色質動態(tài)變化過程

 

可接近的基因組雖然僅占總DNA序列的2~3%，但卻捕獲了90%以上的TFs結合區(qū)域(ENCODE數(shù)據(jù))。除了少數(shù)在兼性或組成性異染色質中富集的TFs外，在ENCODE項目中研究的絕大多數(shù)TFs幾乎特異性地與開放染色質結合。TFs與組蛋白和其他染色質結合蛋白進行動態(tài)競爭，調(diào)節(jié)核小體占據(jù)并促進局部接近DNA；反過來，特定細胞類型的可及性圖譜也可以調(diào)控TF結合。對于多細胞系統(tǒng)，TFs具有廣泛的功能作用，在短時間尺度上提供轉錄的動態(tài)調(diào)控，并建立和維持具有共同基因組的細胞類型的持續(xù)表觀遺傳渠道化(epigenetic canalization)。因此，染色質可及性既反映了整合的TF結合，也反映了遺傳位點的調(diào)控潛力。這一觀點為追蹤決定細胞狀態(tài)的轉錄調(diào)節(jié)因子差異結合的可及性變化奠定了分析基礎。

染色質可及性普遍通過量化染色質對酶甲基化或其組成DNA切割的敏感性來檢測(圖2)。原則上，染色質可及性的檢測取決于所研究的分子；然而，據(jù)報道可及性又具有顯著的保守性。1973年，Hewish和同事使用DNA內(nèi)切酶來片段化染色質，表明核小體在整個基因組中具有周期性的超敏反應。這種周期性可以通過Southern blot雜交檢測，發(fā)現(xiàn)在基因組保守的DNA酶超敏位點(DHSs)之間存在一個典型的100-200bp相位模式。這和隨后的工作為典型的核小體相位提供了最早的直接證據(jù)。類似的技術也被用于將黑腹果蠅染色質重塑與熱休克位點的同時轉錄激活聯(lián)系起來。隨著1985年PCR技術的引入，各種定量方法(如下所述)已經(jīng)發(fā)展起來，可以使用核酸內(nèi)切酶和連接介導的PCR技術來檢測位點特異性的染色質可及性。

圖2 染色質可及性檢測方法原理

 

DNase-seq

全基因組范圍內(nèi)的開放染色質區(qū)域檢測首次在2006年的兩篇研究中發(fā)表，研究通過將DNase I消化后的天然構象的染色質片段雜交到覆蓋1%人類基因組的平鋪芯片上得到這部分序列信息。后續(xù)改進的技術流程采用短讀長測序來定量基因組范圍內(nèi)DNase敏感的染色質相對豐度(DNase I超敏位點測序(DNase- seq)) (圖2a)。Boyle等人使用II型限制性內(nèi)切酶分離并對每個DNA酶切位點進行條形碼標記(單切，single cut)，而Hesselberth等人使用嚴格的片段選擇來富集DHSs中成對切割事件產(chǎn)生的可測序片段(雙切，double cut) (圖2a)。盡管這些測序方法之間有廣泛的共識，Boyle的實驗方法可以鑒定到更多可接近的位置，而Hesselberth方法則提供了一個簡化的實驗流程，并且其中捕獲的來自廣泛的不可接近染色質的片段會更少(更高的信噪比)。總的來說，這些基因組水平的染色質可及性檢測顯示，少數(shù)DHSs位于啟動子和轉錄起始位點(TSS)的近端區(qū)域，超過80%的可接近性區(qū)域位于遠端增強子區(qū)。

 

ATAC-seq

轉座酶可接近染色質測序(ATAC-seq)使用超活性Tn5轉座酶將Illumina測序接頭插入可接近的染色質區(qū)域(圖2b)。與雙切DNase-seq操作方法類似，ATAC-seq選擇性地放大可接近染色質的近端雙切事件。ATAC-seq可及性檢測與雙切(r > 0.8)和單切(r > 0.75) DNase-seq實驗結果均高度相關，盡管在做一些更高分辨率的分析時（例如分析TF印記），兩種技術在測序偏倚性上仍存在差異。由于Tn5介導的接頭連接的高效率，已經(jīng)可以對低至500個數(shù)量的細胞成功構建高度復雜的ATAC-seq文庫。近期也有報道多種ATAC-seq的改進方法，包括Sos等人的一項研究表明，可以利用單個轉座事件的體外轉錄來構建文庫。ATAC-seq之所以被廣泛采用，部分原因是它能夠很好地識別可接近的染色質，而且簡單、快速實施，并能應用于現(xiàn)實條件下有限的臨床和原代組織樣本。值得一提的是，10000-20000個細胞的ATAC-seq文庫通常在2小時內(nèi)完成，相比較而言，DNase-seq通常需要數(shù)百萬個細胞的多天操作流程。盡管已知兩種方法的局部序列偏差不同，但ATAC-seq和DNase-seq捕獲了相似的調(diào)控信息。

 

MNase-seq

鑒于組蛋白在調(diào)節(jié)染色質可及性方面的中心作用，核小體占據(jù)和定位技術——微球菌核酸酶測序(MNase-seq)最近被應用于檢測可及性(圖2c)。MNase既可作為核酸內(nèi)切酶來切割核小體間DNA，也可作為外切酶來降解不受蛋白質保護的片段化DNA。MNase-seq與DNase-seq和ATAC-seq之間的一個顯著區(qū)別是后兩者都沒有發(fā)生核小體DNA切割事件。事實上，MNase可能通過其內(nèi)切酶活性來切割核小體DNA；然而，這類切割事件是否真實存在，因為其自身外切酶介導的片段降解而無從得知。由于MNase對核小體DNA的切割效率低于核小體間DNA，因此該酶被廣泛用于分離跨越單個核小體的片段。先前的研究顯示，某些核小體對MNase的敏感度具有劑量依賴特性，Mieczkowski和其同事利用不同濃度的核酸酶進行MNase-seq，以檢測整個基因組的差異可及性。這種技術，稱為MNase可及性(MACC)，基于MNase-seq文庫中可接近DNA隨核酸酶濃度的增加而減少（可能由于外切酶介導的消化），而受保護的核小體DNA由于內(nèi)切酶介導的切割發(fā)生率增加而表現(xiàn)為相對豐度增加。MACC信號在預測活躍調(diào)控區(qū)域(組蛋白H3賴氨酸27乙?；?span>(H3K27Ac)陽性區(qū)域)高度富集，與TSSs、啟動子和遠端增強子的DNase超敏數(shù)據(jù)相關性較好，但在轉錄終止位點或基因體內(nèi)相關性差。這種差異可能是由于不同方法中片段長度的差異富集或使用的酶探針大小的不同造成。

 

NOMe-seq

核小體占據(jù)和甲基化組測序(NOMe-seq)使用來自M.CviPI的GpC甲基轉移酶(MTase)，這種酶通過對可接近的DNA進行化學修飾而非切割的方式來檢測染色質的可及性(圖2d)。這種新的MTase在GC二核苷酸上產(chǎn)生異常的甲基化，與人類和小鼠基因組中常見的CG二核苷酸上的內(nèi)源性甲基化區(qū)別開來。因此，NOMe-seq在高分辨率下可以同時檢測DNA可及性和甲基化狀態(tài)，因為GpC在整個基因組中頻率很高。重要的是，NOMe-seq并不是一種富集方法，因此需要相對大量的測序reads來獲得足夠的深度來確定整個基因組的可及性水平。然而，由于富集偏差的缺失和該技術的單分子特性，使得其對染色質可及性圖譜的檢測比DNase-seq、ATAC-seq或MNase-seq更能提供定量的信息，因為每個基因組位點的相對可及性水平可以直接測定。

 

單細胞可及性檢測

單細胞可及性變化的檢測有望揭示基因組調(diào)控的一個核心問題：染色質可及性短時間尺度內(nèi)的波動和發(fā)展變化是如何在整個基因組中協(xié)調(diào)的？基于ATAC-seq、DNase-seq和NOMe-seq文庫制備方案，已經(jīng)開發(fā)了多種方法來檢測單個細胞中的染色質可及性。

組合標簽（Combinatorial indexing）為成千上萬的單細胞ATAC-seq文庫加上條形碼（barcode）提供了一種完美的策略。在這種方法中，用帶有獨特的條形碼Tn5酶對純化的細胞核進行多重轉座反應，然后在有限稀釋的條件下混樣并分開進行多重標簽PCR反應。這種方法的原理是任意兩個細胞在轉座后，被后續(xù)混樣和分開PCR的操作中標記上完全相同的兩重標簽的概率很低，因此不需要分離單個細胞。組合標簽已被用于分析黑腹果蠅胚胎發(fā)育的成千上萬個單細胞的可及性，建立了13種不同組織的小鼠細胞類型圖譜，并研究正在發(fā)育的小鼠前腦的轉錄調(diào)控。

單細胞ATAC-seq也可以通過在微流控設備(Fluidigm, C1)或在單個標簽的納米孔芯片中來(Takara Bio, ICELL8)實現(xiàn)捕獲單細胞。微流控捕獲已經(jīng)被用于在早期的造血過程中對成千上萬個單細胞的可及性進行分析，而納米孔芯片有望進一步將微流控方法的通量提高一個數(shù)量級。在選擇使用這兩個平臺還是組合標簽方法時需要作出權衡：微流控和納米孔芯片平臺每次實驗處理的細胞會明顯少于組合標簽方法，但由此產(chǎn)生的單細胞文庫復雜性至少示后者的兩倍。文庫復雜度的差異是一個重要的參數(shù)，因為即使是對無所不在的開放區(qū)域也只是采樣了少量分散的區(qū)域(平均而言，使用C1平臺的單個細胞中只觀察到所有開放區(qū)域的10%)，我們預計這兩種方法的文庫復雜度在近期都將得到改善。單細胞ATAC-seq最近已經(jīng)在10X Genomics公司和Bio-Rad Laboratories公司的基于液滴的微流控平臺上得到了應用。早期的報告表明，這些高通量平臺將提供類似于納米孔捕獲技術的數(shù)據(jù)質量。

轉座酶介導的單細胞染色質可及性分析很快出現(xiàn)了DNase-seq和NOMe-seq的單細胞改進版。結合甲基化、可及性和核小體相位的原理證明以及單細胞NOMe-seq分析，Pott報道了從單細胞尺度能鑒定出5.2-9.5%的DHSs 。雖然單細胞DNase-seq在目前還不容易擴展，但它可以在所有開放染色質中捕獲、生成具有近100,000個獨特reads的顯著復雜性的單細胞可及性片段文庫。盡管DHSs的reads比例略低于基于ATAC-seq的方法(單細胞DNase-seq的占23-26%，而單細胞ATAC-seq的占35-55%)，但在DHSs上觀察到的獨特片段的數(shù)量仍然相對較高。值得注意的是，對于一小部分DHSs，在幾乎所有的單細胞中都可以從這些區(qū)域中鑒定到可接近的片段；此外，來自單個細胞的典型DNase-seq文庫包含來自所有DHSs的35-59%的片段(相比之下，來自單個細胞的ATAC-seq只占10%)?？偟膩碚f，這些原理證明方法為構建單細胞表觀遺傳學技術手段提供了重要的研究方向。

 

解析染色質可及性特征

最近的單分子和單細胞可及性檢測表明，細胞群的可及性檢測代表了不同分子狀態(tài)的總體平均值(圖3)。當觀察潛在的、動態(tài)的、不同步的過程時，這種分子異質性自然會出現(xiàn)。例如，在轉錄位點RNA聚合酶和其他TFs一起取代TSS上游的核小體，并遷移經(jīng)過啟動子下游的定位良好但不穩(wěn)定的核小體(圖3a)。單分子NOMe-seq數(shù)據(jù)的印記分析揭示了這一過程，捕獲了轉錄過程進行時的每個分子狀態(tài)(圖3b)。盡管考慮到采樣效率，可及性的單細胞檢測在全基因組范圍內(nèi)預測的調(diào)控區(qū)域發(fā)現(xiàn)了相似的分子異質性(圖3c)。

圖3 細胞群范圍的染色質可及性檢測反映了異質性的單分子平均的可及性

 

DNase-seq和ATAC-seq對大量細胞群的開放染色質的檢測可被視為總體的TF-結合信號的整合。結合TFs保護DNA不被酶消化，其保護程度與TF對DNA的結合占據(jù)有關?？紤]到它們相對快速的脫去速率，我們可以預期，TFs通常比核小體提供更少的保護。這種精細的TF相關的保護需要使用不同的生物信息學分析方法，利用基因組范圍內(nèi)TF結合親和力和酶切特異的序列偏倚性信息去解析TF結合和染色質結構。可及性結合轉錄數(shù)據(jù)進一步擴展了此分析流程：給定一組不同的細胞類型之間的可接近區(qū)域，在不同的發(fā)展階段或其他實驗條件下，可以發(fā)現(xiàn)哪些TFs是差異表達的，并被推斷結合到差異的可接近的DNA上，而這些TFs可能參與調(diào)控某些表觀遺傳的差異。因此這仍然是一個活躍的領域研究，我們預計未來幾年的焦點集中在整合可及性與其他表觀遺傳檢測的計算方案。

最近，染色質可及性已被用來識別由全基因組關聯(lián)研究(GWAS)產(chǎn)生的因果遺傳變異。人類基因組中大多數(shù)單核苷酸多態(tài)性(SNPs)發(fā)生在非編碼和基因間的基因組區(qū)域，個體對復雜性狀的影響很小或是間接的，因此混淆了因果變異的檢測。最近，一些研究利用染色質的可及性來更好地理解這些非編碼SNPs及其對性狀的影響。例如，Maurano等人發(fā)現(xiàn)許多因果GWAS變異集中在非編碼的DHSs中，通過使用染色質可及性數(shù)據(jù)，可以更準確地關聯(lián)到它們影響的基因。這些結果強調(diào)了將染色質可及性數(shù)據(jù)與功能和其他表觀遺傳數(shù)據(jù)分析相結合的價值。

 

ATAC-seq技術優(yōu)勢及參數(shù)

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