Nature Microbiology：N-酰基乙醇胺可以使健康腸道菌群轉(zhuǎn)化成類似IBD患者腸道菌群

發(fā)稿時間：2020-04-10來源：天昊生物

英文題目: Growth effects of N-acylethanolamines on gut bacteria reflect altered bacterial abundances in inflammatory bowel disease

中文題目：N-?；掖及穼δc道細(xì)菌的生長作用反映了炎癥性腸病中細(xì)菌豐度的變化

期刊名：Nature Microbiology

影響因子：14.3

發(fā)表時間：2020年

單位: Broad Institute of MIT and Harvard

研究摘要:

炎癥性腸?。?span>IBD）與腸道微生物豐度和腸腔代謝產(chǎn)物濃度的變化有關(guān)，但是在健康和疾病中特定代謝產(chǎn)物對腸道菌群的影響仍然未知。在這里，我們分析了IBD中豐度差異的代謝產(chǎn)物對IBD中豐度也存在差異的腸道細(xì)菌生長和生理的影響。我們發(fā)現(xiàn)N-?；掖及罚?span>NAEs），一類內(nèi)源性產(chǎn)生的信號性脂質(zhì)，它在IBD患者和結(jié)腸炎T細(xì)胞轉(zhuǎn)移模型的糞便中富集，并且它能刺激IBD患者中富集的菌種的生長，并抑制了IBD患者中減少的菌種的生長。使用宏基因組測序，我們概述了NAEs在離體的微生物群落中的作用，在NAEs存在的情況下，變形桿菌大量繁殖，擬桿菌減少。對相同微生物群落的宏轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析確定了呼吸鏈的組成部分對NAEs的代謝很重要，并且利用呼吸道復(fù)合體I缺失突變體進(jìn)行了驗證。在這項研究中，我們確定了NAEs是一類在IBD患者中富集的代謝產(chǎn)物，其具有將腸道菌群向類似IBD組成轉(zhuǎn)化的潛力。

研究背景:

炎癥性腸?。?span>IBD），包括潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。?span>CD），是由遺傳易感性以及腸道微生物與宿主免疫之間的相互作用所引起的慢性胃腸道炎癥。目前許多研究集中在IBD期間的微生物和功能改變上，然而，腸道代謝組（包括飲食，宿主和微生物衍生的代謝產(chǎn)物）對腸道健康同樣重要。

某些腸道細(xì)菌將膳食纖維代謝成短鏈脂肪酸（如丁酸），從而滋養(yǎng)結(jié)腸細(xì)胞，促進(jìn)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞擴(kuò)增并具有免疫抑制功能，而IBD患者中的丁酸鹽濃度和產(chǎn)丁酸鹽的細(xì)菌則大大降低。正常情況下，其它細(xì)菌（例如，乳桿菌屬，擬桿菌屬和梭狀芽孢桿菌）將色氨酸轉(zhuǎn)化為吲哚衍生物，可促進(jìn)健康的腸屏障功能和免疫耐受，然而IBD患者腸中吲哚產(chǎn)生菌也枯竭。尿素酶活性促使微生物組向IBD患者常見的失衡狀態(tài)轉(zhuǎn)移，并在鼠結(jié)腸炎模型中使疾病惡化。寄主來源的代謝產(chǎn)物同樣會影響微生物群的組成：IBD患者腸道富集的膽汁酸，能促進(jìn)膽汁酸代謝相關(guān)細(xì)菌的繁殖并抑制膽汁敏感細(xì)菌的生長。

最近的兩項研究結(jié)合了宏基因組學(xué)和非靶向代謝組學(xué)分析，以確定糞便中細(xì)菌物種與代謝物之間的聯(lián)系。第一個是在MGH（PRISM）隊列中針對潰瘍性結(jié)腸炎（UC）患者，克羅恩病（CD）患者和非IBD受試者的橫斷面研究；第二個是人類微生物組計劃（iHMP）。兩者均得出結(jié)論，與IBD相關(guān)的微生物變化，例如包括變形桿菌在內(nèi)的兼性厭氧菌的大量繁殖，都伴隨著代謝物組成的顯著變化。

在本研究，我們調(diào)查了IBD患者中差異變化的腸道代謝產(chǎn)物對IBD患者中同樣差異變化的腸道細(xì)菌生長的影響，發(fā)現(xiàn)包括胺和脂肪酸在內(nèi)的代謝產(chǎn)物強烈影響細(xì)菌的生長。亞油酸乙醇胺（LEA），一種NAE，可以影響IBD患者細(xì)菌豐度的變化。結(jié)果顯示LEA和三種與結(jié)構(gòu)相關(guān)的NAE（棕櫚酰乙醇酰胺（PEA），油酰乙醇酰胺（OEA）和花生四烯酰乙醇酰胺（AEA））都在IBD患者和結(jié)腸炎T細(xì)胞轉(zhuǎn)移鼠模型的糞便中得到富集。這些NAE具有共同的受體，并且是內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的一部分。本研究用這些NAEs處理了在IBD中改變的細(xì)菌的純培養(yǎng)物，證明了NAE促進(jìn)了IBD中富集的菌種的生長，并限制了那些在IBD中減少的菌種的生長。來源于健康受試者和NAE處理的體外細(xì)菌群落的宏基因組測序顯示，其物種變化與IBD患者體內(nèi)觀察到的物種豐度變化趨勢類似。對這些群落的轉(zhuǎn)錄組分析表明，響應(yīng)NAE，腸桿菌科中呼吸電子轉(zhuǎn)運鏈成分的表達(dá)增加。這些離體結(jié)果暗示了與IBD相關(guān)的微生物群落改變與宿主內(nèi)源性大麻素系統(tǒng)的上調(diào)有關(guān)。

研究結(jié)果：

腸道代謝物影響腸道細(xì)菌的生長

先前研究已經(jīng)針對PRISM隊列受試者的糞便進(jìn)行了代謝物分析，確定了3829個特征代謝物，其中466個已使用參考標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行了驗證。從這些經(jīng)過驗證的代謝產(chǎn)物中，我們選擇了50種代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IBD和非IBD糞便之間有32個代謝物具有差異。我們使用微量滴定板量化了代謝物對細(xì)菌指數(shù)期（V max）和穩(wěn)定生長期（最大OD 600 nm）生長的影響（圖1a）。

在5種腸道細(xì)菌上測試了每種代謝物單一濃度的影響：E. coli、R. gnavus、B. producta、B. fragilis、B. cellulosilyticus。在PRISM隊列中，IBD患者中E. coli, R. gnavus和B. producta更為豐富，而B. cellulosilyticus在IBD患者中則是減少的。盡管B. fragilis在PRISM隊列中差異不大，但由于在其它IBD隊列中觀察到其與宿主免疫的相互作用較多，同時發(fā)現(xiàn)Bacteroides在IBD患者中則是減少的，因此我們納入了B. fragilis。結(jié)果發(fā)現(xiàn)50％以上的受試代謝產(chǎn)物促進(jìn)了E. coli, R. gnavus和B. producta的生長，而只有d-鞘氨醇和植物鞘氨醇抑制了它們的生長（圖1b）。相反，B. cellulosilyticus只有被少數(shù)代謝產(chǎn)物促進(jìn)生長（18％），而50％以上的代謝產(chǎn)物則抑制了其生長，這其中大部分代謝物在IBD中得到富集。

為了驗證單劑量生長效應(yīng)，在三種菌株上以多種劑量測試了抑制或促進(jìn)至少一種菌種生長的七種代謝物，這些代謝物包含：胺（LEA），甘油磷酸膽堿（C16：0溶血磷脂酰膽堿（LPC）），多元醇（泛酸），脂肪酸（癸二酸和十二烷二酸），甘油脂（2-棕櫚酰甘油）和亞油?；▉喡樗幔６鄤┝糠治鲎C實LEA抑制B. fragilis生長，并且不影響E. coli的生長，而R. gnavus僅在最高LEA濃度時才延遲其遲滯期。B. fragilis生長不受單劑量的癸二酸和十二烷二酸的影響，但在多劑量試驗中可明顯增強；癸二酸和十二烷二酸對E. coli的生長有中等程度的抑制作用。在較高劑量下，亞麻酸延遲了B. fragilis, R. gnavus 和 E. coli的指數(shù)生長，同時增強了B. fragilis的穩(wěn)定生長期生長。這些結(jié)果突出了測試一定劑量范圍的代謝物對細(xì)菌生長的重要性，以評估代謝物作用的全部程度。

圖1糞便代謝產(chǎn)物對細(xì)菌指數(shù)期（V max）和穩(wěn)定生長期（最大OD 600 nm）生長的影響

NAEs在IBD患者和鼠結(jié)腸炎模型的糞便中富集

在IBD患者中富集的LEA，可以抑制B. cellulosilyticus的生長，可以促進(jìn)E. coli, R. gnavus和B. producta生長（圖1b，c），這與IBD中這些細(xì)菌類群的豐度變化相一致。接著我們確定了IBD患者中富集的另外三種NAE：PEA，OEA和AEA（圖2a）。我們使用先前驗證PEA，OEA和LEA的LC-MS方法，確認(rèn)了PRISM受試者糞便中存在AEA。雖然PEA，OEA和LEA僅在克羅恩?。?span>CD）樣品中富集，但AEA在CD和UC中都富集。

我們在獨立IBD隊列中檢測了NAE豐度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與非IBD樣品相比，微生物差異最顯著的CD / UC樣品中的NAE含量最高（圖2b），這支持NAE與IBD中微生物組成改變之間的聯(lián)系。由于所使用的LC-MS方法不能產(chǎn)生絕對濃度，因此我們通過對PRISM隊列樣本中的NAE進(jìn)行定量分析，進(jìn)一步證實了IBD患者糞便中NAE升高（圖2c）。

為了研究相關(guān)動物模型在炎癥過程中NAEs是否升高，我們測量了從Rag2-/-小鼠收集的糞便中的NAE濃度（在誘發(fā)結(jié)腸炎之前和之后）。因為Rag2-/-小鼠無法產(chǎn)生成熟的B和T淋巴細(xì)胞，所以將天然T細(xì)胞從野生型供體小鼠轉(zhuǎn)移到Rag2-/-小鼠中，從而誘發(fā)結(jié)腸炎。在無特定病原體（SPF）的條件下飼養(yǎng)了Rag2-/-小鼠，并在第0周（將天然T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Rag2-/-小鼠之前）收集了糞便，然后轉(zhuǎn)移了從野生型小鼠獲得的T細(xì)胞，六周后，結(jié)腸炎在接受T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的Rag2-/-小鼠中發(fā)生，但在未接受T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的Rag2-/-小鼠中未發(fā)生。相對于T細(xì)胞轉(zhuǎn)移前同一小鼠（第0周）或者沒有接受T細(xì)胞轉(zhuǎn)移的小鼠，在T細(xì)胞轉(zhuǎn)移六周后收集的糞便中檢測到所有四種NAE的濃度得到增加，并與患者發(fā)現(xiàn)的濃度相似（圖2d）。

我們還對這些樣品進(jìn)行了宏基因組測序，以鑒定與NAE豐度相關(guān)的細(xì)菌分類群。在與PRISM樣品中發(fā)現(xiàn)的共有的物種中，我們觀察到患有結(jié)腸炎的小鼠具有相同的豐度趨勢：T細(xì)胞轉(zhuǎn)移后，Akkermansia, Alistipes和Eubacterium豐度減少，而Enterococcus豐度增加。因此， NAE豐度的增加和相應(yīng)的細(xì)菌群落變化都是小鼠和人類結(jié)腸炎的特征。

圖2  在IBD患者和結(jié)腸炎小鼠模型中，NAE升高

NAEs促進(jìn)了IBD患者中富集的物種的生長，并抑制了IBD患者中減少的物種的生長

為了評估對PRISM隊列差異物種的生長效應(yīng)，以兩種劑量在11種菌株上測試了4種NAE：最初的篩選中使用的3種參考菌株；IBD患者富集的1種參考菌株（Lactobacillus gasseri）；從人糞便中分離出的7種菌株（IBD中的3個富集菌種，3個減少菌種和1個不變的菌種）。從劑量生長曲線推導(dǎo)出V max和最大OD 600 nm，繪制成NAE濃度的函數(shù)以確定其生長效應(yīng)（圖3a，b）。NAE處理后，所有測試的IBD患者富集的物種的生長均得到增強，而IBD患者減少的物種的生長則受到抑制。加入OEA和LEA可使生長增強最強，而LEA和AEA的抑制作用最強，PEA對增長的影響很小。

PRISM隊列的宏基因組和代謝組學(xué)分析相結(jié)合，使我們能夠認(rèn)識到IBD中差異豐富的細(xì)菌物種和代謝物之間的潛在機(jī)制聯(lián)系（圖3c）。當(dāng)將人類協(xié)變量數(shù)據(jù)與我們的體外生長分析進(jìn)行比較時，如關(guān)聯(lián)模型所預(yù)測的一樣，大多數(shù)菌株都對NAE有反應(yīng)（圖3b與圖3c）。

為了解釋調(diào)控細(xì)菌對NAE應(yīng)答的分子機(jī)制，解析了LEA和AEA（其抑制作用最強）處理的B. fragilis的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)（圖3b）。選擇B. fragilis是因為它是一個經(jīng)過充分研究的物種，屬于經(jīng)常在IBD中減少的菌。在LEA和AEA處理B. fragilis中，最上調(diào)的基因編碼在外排轉(zhuǎn)運中起作用的膜相關(guān)蛋白，表明所有上調(diào)的外排轉(zhuǎn)運基因可能在將NAE和其它脂肪酰胺主動泵出細(xì)胞或細(xì)胞質(zhì)的途徑中發(fā)揮作用；下調(diào)最嚴(yán)重的基因編碼一種外膜蛋白，與E. coli FadL (BF9343_1322)同源，后者是一種長鏈脂肪酸（LCFA）的導(dǎo)入者。在LCFA代謝中同樣重要的是，電子通過轉(zhuǎn)移性黃素蛋白從脫氫酶轉(zhuǎn)移到膜結(jié)合的呼吸鏈上，響應(yīng)LEA和AEA，兩個電子轉(zhuǎn)移黃素蛋白亞基（BF9343_3116和BF9343_3117）均下調(diào)。這些數(shù)據(jù)表明B. fragilis i可抑制NAE的轉(zhuǎn)運和代謝，同時促進(jìn)其外排。

圖3  NAEs對細(xì)菌生長的影響

NAEs使離體腸道群落向類似IBD組成轉(zhuǎn)變

為了確定在單培養(yǎng)細(xì)菌中觀察到的NAE的生長效應(yīng)是否在細(xì)菌群落中可以得到重復(fù)，我們在兩個化學(xué)恒溫器（A和B）中均接種了來自不同健康人供體的糞便，將樣品分別與四個NAE分開處理，然后混合（表示為NAE-mix），同時二甲基亞砜（DMSO）處理作為對照。我們收集了處理前和處理后1、4、8、12和24小時的樣本，以進(jìn)行宏基因組和宏轉(zhuǎn)錄組測序。分析測序的物種組成，我們在處理前鑒定出66種（化學(xué)恒溫器A）和85種（化學(xué)恒溫器B）。在兩個化學(xué)恒溫器中均發(fā)現(xiàn)了單培養(yǎng)時的細(xì)菌：E. coli, Alistipes shahii和S. salivarius；在化學(xué)恒溫器B中檢測到了chemostats.B. fragilis和B. producta。

在恒化器A中， 12小時后最極端的影響出現(xiàn)在AEA中，幾乎完全被Enterobacteriaceae所取代（圖4a）。LEA和NAE混合處理的趨勢相似。OEA處理不影響Enterobacteriaceae的豐度，但增加了Enterococcaceae和Streptococcaceae的相對豐度，而降低了Bacteroidaceae和Rikenellaceae的相對豐度（圖4b）。

除PEA外，所有NAEs處理后的Alistipes和Bacteroides的豐度均降低（圖4c），這與單培養(yǎng)觀察結(jié)果（圖3b）以及在PRISM 和iHMP IBD受試者中的Bacteroidetes減少一致。在PRISM IBD受試者中，腸桿菌Barnesiella intestinihominis受到抑制，其在體外群落中也被AEA，LEA和NAE-mix抑制。在物種水平上，B. producta和Clostridium clostridioforme的豐度隨著AEA，LEA和NAE-mix處理增加，而這兩種物種在PRISM IBD受試者中均富集。在相同條件下，Klebsiella pneumoniae和Proteus mirabilis也增加，而iHMP IBD受試者中Klebsiella pneumoniae也明顯富集，此外這兩個物種在小鼠模型中與結(jié)腸炎發(fā)生有關(guān)。這些結(jié)果都表明LEA，AEA和NAE的組合足以將離體微生物群落從健康群落轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃?span>IBD患者的群落組成。

圖4 NAEs對體外微生物群落組成的影響

轉(zhuǎn)錄變化突出了對NAE的抗氧化響應(yīng)

響應(yīng)NAE處理，微生物群落中轉(zhuǎn)錄活性同時也發(fā)生變化（圖5）。KEGG模塊的顯著變化包括氨基酸，輔因子，維生素，碳水化合物，聚糖和脂質(zhì)代謝功能。在AEA的存在下，檸檬酸鹽循環(huán)的厭氧，還原性（M00150）和氧化性（M00010）分支均被上調(diào)，這是由腸桿菌科Enterobacteriaceae驅(qū)動的。NAEs處理后伴隨能量代謝增加的是呼吸電子轉(zhuǎn)運鏈的上調(diào)。鑒于復(fù)合物I（M00144）是有氧條件下大腸桿菌中的OA代謝所必需的，我們測試了復(fù)合物I對厭氧條件下NAE代謝是否重要。我們在OA，OEA或LEA的存在下培養(yǎng)了野生型和復(fù)合物I缺陷型（ΔnuoB）大腸桿菌菌株，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與野生型不同，OA或NAE不會促進(jìn)ΔnuoB突變體的生長，這突出了功能性呼吸鏈對NAE代謝的必要性。在AEA和LEA的存在下，泛醌也得到增強，泛醌是大腸桿菌中與膜相關(guān)的輔酶，可將電子從復(fù)合物I轉(zhuǎn)移到最終電子受體，在有氧條件下，泛醌可防止脂肪酸代謝產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，這些結(jié)果表明，其功能對于厭氧條件下的NAE代謝同樣重要。

假設(shè)乙醇胺基團(tuán)裂解后NAEs像LCFAs一樣代謝，我們研究了厭氧條件下在大腸桿菌中運行的好氧β-氧化模塊（M00086）和KO（K12507，K01782和K00626）。在恒化器群落中，厭氧脂肪酸降解功能保持不變，M00086對OA和NAEs的反應(yīng)受到抑制，這表明感興趣的途徑未充分測量，或者其它脂肪酸降解機(jī)理在厭氧條件下起作用。另外，響應(yīng)于AEA，LEA和NAE-mix，涉及乙醇胺利用的微生物群落功能（K04024和K04027）被上調(diào)，表明NAE分解。兩個恒化器組合的聯(lián)合轉(zhuǎn)錄組分析強調(diào)了呼吸鏈對腸桿菌科NAE新陳代謝的必要性。

圖5  響應(yīng)NAE處理，微生物群落中轉(zhuǎn)錄活性的變化