人SMN1/SMN2基因拷貝數(shù)檢測試劑盒

發(fā)稿時間：2020-03-18來源：天昊基因

背景介紹

脊髓性肌萎縮癥（Spinal Muscular Atrophy，SMA）是一種源于脊髓前角退變引起肌無力和肌萎縮的神經(jīng)系統(tǒng)遺傳性疾病，屬常染色體隱性遺傳病。活產(chǎn)嬰兒的發(fā)病率為I／6000～I／10 000，人群攜帶者頻率為1／40～1／50，居兒童致死性常染色體遺傳病的第2位。

根據(jù)發(fā)病年齡和進程將SMA分為四種類型：嬰兒型（SMA I型），中間型（SMA II型），少年型（SMA III型）和成年型（SMA IV型）。四種類型SMA基因位點均在5號染色體上。運動神經(jīng)元存活基因1（SMN1）的外顯子純合缺失（90-95%）或SMN1缺失/點突變（或部分缺失）（3~5%）的復合雜合突變是導致該疾病發(fā)生的主要原因。 SMN1: c.22dupA是中國人群報道頻率最高的點突變，在SMA病人中其頻率近1%。運動神經(jīng)元存活基因2（SMN2）基因會轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生10-20%全長有功能的轉(zhuǎn)錄本，因此在SMA病人中，SMN2基因拷貝數(shù)與臨床表型嚴重程度密切相關(guān)，SMN2僅1拷貝96%可能是SMA I型，而SMN2>=4拷貝~90%可能是SMA III/IV型。有研究報道,在SMA病人中，SMN基因下游的神經(jīng)元凋亡抑制蛋白基因(NAIP)的缺失可能與更嚴重臨床表型相關(guān)。因此，基因檢測是確診SMA的金標準。      

產(chǎn)品介紹

用于人SMN1/SMN2基因拷貝數(shù)檢測。該檢測體系共設(shè)計16對探針，通過采集人基因組DNA，應用公司自主研發(fā)且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的AccuCopy^?多重熒光競爭性PCR （授權(quán)專利號：ZL201010180551.2，Du et al, 2012）與等位基因特異性熒光PCR技術(shù)組合，用于SMN1及SMN2基因的拷貝數(shù)檢測， 也可以檢測人基因組DNA中是否存在SMN1: c.22dupA突變以及NAIP基因的拷貝數(shù)，同時對SMN1基因可能存在部分外顯子（如E1-E4, E6-E8) 缺失給出提示。該檢測產(chǎn)品主要的開展領(lǐng)域為婦產(chǎn)科，作為SMA的攜帶者篩查對所有備孕期或孕早期的夫婦進行普篩，以及SMA攜帶者的優(yōu)生優(yōu)育指導和產(chǎn)前診斷，還可在神經(jīng)科用于SMA的確診、輔助判斷SMA的嚴重程度。

檢測內(nèi)容：

檢測SMN1、SMN2的拷貝數(shù)，并可對中國人高頻點突變SMN1 c.22dupA以及NAIP基因的拷貝數(shù)，及SMN1、SMN2的融合基因進行檢測，并可對SMN1基因可能存在部分外顯子（如E1-E4, E6-E8) 缺失給出提示

產(chǎn)品優(yōu)勢

1、超高精準檢測：采用天昊診斷公司自主研發(fā)且具有自主知識產(chǎn)權(quán)的拷貝數(shù)檢測技術(shù)AccuCopy?多重熒光競爭性PCR進行檢測，平均檢測CV<5%；

2、檢測范圍廣：可對SMN1及SMN2 8拷貝內(nèi)的變異進行準確檢測，還可對中國人高頻點突變SMN1 c.22dupA以及NAIP基因的拷貝數(shù)，及SMN1、SMN2的融合基因進行檢測，并可對SMN1基因可能存在部分外顯子（如E1-E4, E6-E8) 缺失給出提示；

3、疾病判斷更精確： 加入SMN2、NAIP拷貝數(shù)檢測，更有利于輔助判斷SMA的嚴重程度；

4、使用范圍廣：可用于正常人群的SMA攜帶者篩查及SMA患者的基因診斷；

5、高效快速： 5小時之內(nèi)完成實驗，軟件自動精準判讀結(jié)果；

技術(shù)原理：

通過取一定量的競爭性DNA片段混合物（每個競爭性DNA片段與各自對應基因片段通常僅有2-3bp差別），然后與合適量的檢測樣本DNA混合，隨后利用多重熒光PCR引物對檢測樣本DNA及競爭性DNA片段混合物進行參照基因片段和目標基因片段的擴增；多重PCR產(chǎn)物經(jīng)熒光毛細管電泳后根據(jù)擴增長度差異進行分離，獲取不同基因片段的檢測樣本峰（S）以及競爭性DNA峰（C）的峰高值；分析每個基因片段的S/C峰高比值（稱R值），然后將目標基因R值除以參照基因R值獲得RR值(用于校正不同檢測樣本DNA用量差異)，通過將檢測樣本的RR值除以參照樣本的RR值（用于校正不同基因片段對應競爭性DNA的用量差異）后再乘以參照樣本在該目標基因上的拷貝數(shù)即可獲得目標基因的精確拷貝數(shù)。

 

技術(shù)對比：

檢測技術(shù)	位點數(shù)	檢測時間	部分缺失	操作	準確性	樣本要求	結(jié)果判讀
qPCR	單反應、單位點，單參照，位點之間不能相互校正，不能檢測更多的點突變和部分缺失	3小時	無法檢測	復雜（涉及到多次重復實驗，否則假陽性率高）	低（無重復，假陽性、假陰性率較高，特別是對于攜帶者篩查；重復反應，其CV約15-20%）	正常抽提樣本	標準化判讀
MLPA	多重位點，含多個參照位點，位點設(shè)計沒有針對國人突變的熱點	24小時	可以檢測	復雜（實驗操作繁瑣，每次需至少5個對照）	中（一個經(jīng)典技術(shù)，平均CV保持在10%-20%）	樣本質(zhì)量要求高，同批次檢測樣本需相同試劑同批次抽提	軟件判讀，需要經(jīng)驗
AccuCopy	多重位點，含3-4個參照位點；位點之間相互校正，有望新增10個突變位點	4小時	可以檢測	簡單（每次只需對照DNA及陰性對照各1個）	高（自主專利技術(shù)，位點之間相互校正，平均CV<5%）	正常抽提樣本	軟件自動化判讀，柱形圖使結(jié)果更加直觀

檢測流程

 

檢測效果

應用AccuCopy^?多重熒光競爭性PCR與等位基因特異性熒光PCR技術(shù)檢測

 

正常樣本   SMN1=2   SMN2=2   NAIP=2

 

SMA攜帶者樣本   SMN1=1   SMN2=3   NAIP=1

 

SMA攜帶者樣本   SMN1=1   SMN2=1   NAIP=2

 

SMA患者樣本   SMN1=0   SMN2=3   NAIP=1

 

SMA患者樣本   SMN1=0   SMN2=2   NAIP=1

 

SMA患者樣本 SMN1=0   SMN2=4   NAIP=1

 

參考文獻

1. Du R, Lu C et al., Efficient typing of copy number variations in a segmental duplication-mediated rearrangement hotspot using multiplex competitive amplification. J hum Genet. 2012. 57(8):545-51

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