Nature Microbiology：厭氧消化鏈球菌促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生及調(diào)節(jié)腫瘤免疫

發(fā)稿時(shí)間：2020-03-05來(lái)源：天昊生物

 

英文題目: Peptostreptococcus anaerobius promotes colorectal carcinogenesis and modulates tumour immunity

中文題目：厭氧消化鏈球菌促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)生及調(diào)節(jié)腫瘤免疫

期刊名：Nature Microbiology

影響因子：14.3

研究摘要:

新的證據(jù)表明腸道微生物群在結(jié)直腸癌（CRC）中的作用。厭氧消化鏈球菌（P. anaerobius）是一種選擇性富集在結(jié)直腸癌患者糞便和粘膜微生物群中的厭氧菌，但其促腫瘤發(fā)生的致病作用和分子機(jī)制尚不清楚。我們證明厭氧假單胞菌粘附在結(jié)直腸癌粘膜上，加速了Apc ^Min/+小鼠結(jié)直腸癌的發(fā)展。體外實(shí)驗(yàn)和透射電鏡顯示，與正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（NCM460）相比，厭氧消化鏈球菌有選擇性地粘附在結(jié)直腸癌細(xì)胞系（HT-29和Caco-2）上。我們鑒定了一種厭氧消化鏈球菌表面蛋白，即假定的細(xì)胞壁結(jié)合重復(fù)序列2（PCWBR2），它通過(guò)α2/β1整合素直接與結(jié)腸細(xì)胞系相互作用，α2/β1整合素是一種經(jīng)常在人結(jié)直腸癌和細(xì)胞系中過(guò)表達(dá)的受體。PCWBR2與整合素α2/β1的相互作用通過(guò)磷酸化粘著斑激酶激活結(jié)直腸癌PI3K-Akt細(xì)胞通路，從而促進(jìn)細(xì)胞增殖和激活核因子活化B細(xì)胞輕鏈增強(qiáng)子(NK-κB)，NF-κB反過(guò)來(lái)會(huì)觸發(fā)促炎反應(yīng)，例如厭氧消化鏈球菌處理的Apc Min/+小鼠腫瘤中的細(xì)胞因子IL-10和INF-γ水平增加。對(duì)厭氧芽孢桿菌處理的Apc Min/+小鼠腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞群的分析顯示，與慢性炎癥和腫瘤進(jìn)展相關(guān)的髓源性抑制細(xì)胞、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞性腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞顯著擴(kuò)張。RGDS肽、小干擾RNA或抗體對(duì)整合素α2/β1的阻斷均能在體內(nèi)外抑制厭氧消化鏈球菌的附著，并消除厭氧消化鏈球菌介導(dǎo)的致癌反應(yīng)?？傊?，我們發(fā)現(xiàn)厭氧消化鏈球菌通過(guò)PCWBR 2-整合素α2/β1-PI3K-Akt-NF-κB信號(hào)軸驅(qū)動(dòng)CRC，并確定PCWBR 2-整合素α2/β1信號(hào)軸是CRC潛在的治療靶點(diǎn)。

研究背景:

結(jié)直腸癌是世界上最常見(jiàn)的癌癥之一。它的發(fā)生和發(fā)展涉及遺傳、表觀遺傳和環(huán)境因素之間的復(fù)雜相互作用，后者是結(jié)直腸癌的主要誘因。新的證據(jù)表明腸道微生物可能是促進(jìn)結(jié)直腸癌發(fā)展的重要環(huán)境因素。大規(guī)模的宏基因組測(cè)序研究表明，結(jié)直腸癌患者的粘膜和糞便微生物群組成與健康人不同。微生物失調(diào)在結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制中起著重要的作用，已被證實(shí)能調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌的病理功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡和免疫反應(yīng)。 一些“驅(qū)動(dòng)”細(xì)菌，如產(chǎn)腸毒素的Bacteroides fragilis和Fusobacterium nucleatum被發(fā)現(xiàn)與結(jié)直腸癌的發(fā)展有關(guān)。這些微生物可以通過(guò)與宿主癌細(xì)胞直接相互作用、分泌致癌毒性因子或產(chǎn)生致癌微生物代謝產(chǎn)物來(lái)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展。因此，對(duì)CRC相關(guān)致病菌的鑒定和解析具有重要的意義。

為了鑒定與結(jié)直腸癌相關(guān)的微生物種類(lèi)，我們最近分別使用宏基因組測(cè)序和16S擴(kuò)增子測(cè)序?qū)Y(jié)直腸癌糞便和粘膜微生物群的組成進(jìn)行了兩次大規(guī)模的鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了結(jié)直腸癌或腺瘤富集的細(xì)菌菌株，包括已知的與結(jié)直腸癌相關(guān)的F. nucleatum和Peptostreptococcus stomatis。我們還發(fā)現(xiàn)厭氧消化鏈球菌（P.anaerobius）是一種選擇性富集在結(jié)直腸癌患者糞便和粘膜中的細(xì)菌。厭氧消化鏈球菌是一種革蘭氏陽(yáng)性厭氧菌，通常生活在口腔和腸道。我們進(jìn)一步證明厭氧假單胞菌能促進(jìn)偶氮甲烷處理的小鼠結(jié)腸發(fā)育不良，并誘導(dǎo)膽固醇生物合成以支持結(jié)腸細(xì)胞增殖。然而，厭氧消化鏈球菌在自發(fā)性結(jié)直腸癌中的作用及其在腫瘤發(fā)生中的分子機(jī)制仍不清楚。

本研究探討了厭氧消化鏈球菌對(duì)小鼠自發(fā)結(jié)直腸癌形成和發(fā)展的影響及其分子機(jī)制。我們發(fā)現(xiàn)厭氧消化鏈球菌促進(jìn)Apc^Min/+小鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生。厭氧消化鏈球菌通過(guò)其表面蛋白，即假定的細(xì)胞壁結(jié)合重復(fù)序列2（PCWBR2）介導(dǎo)這種作用，它直接與上皮細(xì)胞受體整合素α2/β1相互作用，啟動(dòng)激活PI3K-Akt-NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞增殖和促進(jìn)炎癥的免疫微環(huán)境。阻斷PCWBR2和整合素α2/β1之間的相互作用可消除厭氧消化鏈球菌介導(dǎo)的Apc^Min/+小鼠結(jié)直腸癌。因此，本研究確定了厭氧消化鏈球菌（P. anaerobius）參與結(jié)直腸癌的機(jī)制，并確定了PCWBR2-整合素α2/β1相互作用作為結(jié)直腸癌潛在的藥物靶點(diǎn)。

研究結(jié)果：

厭氧消化鏈球菌促進(jìn)Apc^Min/+小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生

為了測(cè)試厭氧消化鏈球菌（P. anaerobius）對(duì)結(jié)直腸癌發(fā)生的影響，我們使用了Apc^Min/+小鼠，一種自發(fā)性結(jié)直腸癌的基因小鼠模型。在使用抗生素耗盡微生物群2周后，每天給小鼠灌胃1×10⁸c.f.u.的厭氧消化鏈球菌，連續(xù)灌胃10周。另外兩組小鼠（陰性對(duì)照）接受非致瘤性腸道微生物灌胃，例如大腸桿菌（E.coli）MG1655（1×10⁸c.f.u.）或PBS，另一組小鼠灌胃F. nucleatum（1×10⁸c.f.u.）作為陽(yáng)性對(duì)照。定量PCR（qPCR）證實(shí)接種后厭氧消化鏈球菌在結(jié)腸組織中定植。處理10周后檢查結(jié)腸腫瘤的多樣性和重量。與用大腸桿菌MG1655或PBS處理的模型小鼠相比，厭氧消化鏈球菌處理小鼠的腫瘤多樣性和腫瘤重量顯著增加（圖1a）。厭氧消化鏈球菌（P. anaerobius）和F. nucleatum對(duì)結(jié)腸腫瘤的作用無(wú)顯著性差異。所有結(jié)腸腫瘤均經(jīng)組織學(xué)證實(shí)（圖1b）。厭氧消化鏈球菌處理的模型小鼠也顯示出顯著高于用大腸桿菌MG1655（0%HGD）或PBS（12.5%HGD）處理的模型小鼠的高度不典型增生（63.6%HGD）（圖1c）。與大腸桿菌MG1655或PBS組相比，厭氧消化鏈球菌還增加了模型小鼠小腸的腫瘤大小。這些結(jié)果表明厭氧消化鏈球菌加速了Apc^Min/+小鼠結(jié)直腸癌的發(fā)生。

圖1厭氧消化鏈球菌促進(jìn)Apc^Min/+小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生

 

厭氧消化鏈球菌在Apc^Min/+小鼠結(jié)腸腫瘤組織中定位和富集

鑒于厭氧消化鏈球菌在Apc^Min/+小鼠的組織活檢中富集并促進(jìn)結(jié)腸腫瘤的發(fā)生，我們推測(cè)厭氧消化鏈球菌可能位于腫瘤或其微環(huán)境中。為了檢測(cè)厭氧消化鏈球菌的組織定位，我們用厭氧消化鏈球菌寡核苷酸探針對(duì)Apc^Min/+小鼠的結(jié)腸腫瘤和癌旁組織進(jìn)行了熒光原位雜交（FISH）。如圖1d所示，與相鄰的正常組織切片相比，厭氧消化鏈球菌在結(jié)腸腫瘤中富集。此外，qPCR分析證實(shí)Apc^Min/+小鼠結(jié)腸腫瘤中的厭氧消化鏈球菌水平高于癌旁組織（P=0.0098）（圖1e）。

圖1厭氧消化鏈球菌促進(jìn)Apc^Min/+小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生

 

厭氧消化鏈球菌優(yōu)先附著于結(jié)直腸癌細(xì)胞系。

由于我們證明厭氧消化鏈球菌在Apc^Min/+小鼠結(jié)腸腫瘤中定植，我們接下來(lái)使用兩個(gè)結(jié)直腸癌細(xì)胞系（HT-29和Caco-2）和一個(gè)正常結(jié)腸粘膜上皮細(xì)胞系（NCM460）在體外研究厭氧消化鏈球菌的粘附特性。細(xì)菌附著試驗(yàn)顯示厭氧消化鏈球菌附著在所有三種細(xì)胞系上；然而，與NCM460細(xì)胞相比，它顯著增加了對(duì)兩種CRC細(xì)胞系的附著（圖2a）。相比之下，非腫瘤性大腸桿菌MG1655沒(méi)有明顯地附著在CRC細(xì)胞系或NCM460細(xì)胞系上（圖2a）。接下來(lái)，我們用透射電子顯微鏡（TEM）觀察厭氧消化鏈球菌的附著。透射電鏡圖像證實(shí)厭氧消化鏈球菌附著在所有三種結(jié)腸細(xì)胞系上（圖2b）。大腸桿菌MG1655 作為陰性對(duì)照在所有三個(gè)細(xì)胞系中均未顯示出附著（圖2b）。此外，熒光標(biāo)記厭氧消化鏈球菌的實(shí)時(shí)成像證實(shí)了其直接附著于Caco-2細(xì)胞。這些數(shù)據(jù)表明厭氧消化鏈球菌可能通過(guò)與結(jié)腸上皮細(xì)胞的直接相互作用發(fā)揮其致癌作用，特別是在轉(zhuǎn)化細(xì)胞系中。

圖2厭氧消化鏈球菌通過(guò)其表面蛋白PCWbr2附著在結(jié)腸細(xì)胞上。

厭氧消化鏈球菌表面蛋白PCWBR2與結(jié)直腸癌細(xì)胞上的整合素α2 /β 1結(jié)合。

由于厭氧消化鏈球菌優(yōu)先附著于結(jié)直腸癌細(xì)胞系，鑒定能夠與宿主細(xì)胞受體結(jié)合的表面蛋白對(duì)于理解厭氧消化鏈球菌的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。利用Far-western blot方法我們從厭氧消化鏈球菌中鑒定出八種與HT-29細(xì)胞生物素化表面膜蛋白相互作用的候選蛋白（圖2c），然后將相應(yīng)的條帶通過(guò)質(zhì)譜進(jìn)行候選互作蛋白質(zhì)鑒定，在已鑒定的蛋白質(zhì)中，PCWBR2是唯一的厭氧消化鏈球菌表面蛋白（圖2d）。PCWBR2由762個(gè)氨基酸殘基組成，預(yù)測(cè)分子量為81.6kda。在E. coli大腸桿菌和F. nucleatum中，用蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)基本局部比對(duì)搜索工具未發(fā)現(xiàn)具有顯著序列相似性的蛋白質(zhì)。為了驗(yàn)證厭氧消化鏈球菌PCWBR2蛋白與HT-29和Caco-2細(xì)胞系表面膜蛋白的結(jié)合，我們使用生物素pull-down實(shí)驗(yàn)拉下與生物素標(biāo)記的HT-29和Caco-2細(xì)胞表面膜蛋白相互作用的厭氧消化鏈球菌表面蛋白，并通過(guò)質(zhì)譜法確認(rèn)其特性。如圖2e所示，PCWBR2被鑒定為主要結(jié)合蛋白，總之，這些結(jié)果表明PCWBR2可能與HT-29和Caco-2細(xì)胞的表面受體結(jié)合。

圖2厭氧消化鏈球菌通過(guò)其表面蛋白PCWbr2附著在結(jié)腸細(xì)胞上。

接下來(lái)，我們?cè)噲D鑒定與PCWBR2互作的HT-29細(xì)胞上的相應(yīng)細(xì)胞表面受體。因此，我們?cè)诖竽c桿菌中過(guò)表達(dá)谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）標(biāo)記的PCWBR2（GST-PCWBR2）重組蛋白，并對(duì)HT-29細(xì)胞膜蛋白進(jìn)行GST pull-down實(shí)驗(yàn)。銀染和質(zhì)譜鑒定出16種與GST-PCWBR2相互作用的候選蛋白。其中，兩種膜蛋白被鑒定為整合素α2（帶1）和β1（帶3）（圖3a）。除整合素α2/β1外，anoctamin-1是另一種與PCWBR2相互作用并與結(jié)直腸癌相關(guān)的表面膜蛋白。然而，驗(yàn)證工作顯在4小時(shí)共培養(yǎng)后厭氧消化鏈球菌不促進(jìn)anoctamin-1的表達(dá)。為了驗(yàn)證PCWBR2與整合素α2/β1之間的相互作用，在4個(gè)結(jié)腸細(xì)胞系NCM460、HT-29、Caco-2和SW48中進(jìn)行了GST pull-down實(shí)驗(yàn)。Western blot分析顯示，PCWBR2特異性地拉下整合素α2和β1（圖3b）。最后，使用純化的整合素α2和β1蛋白GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)了整合素α2和β1與PCWBR2的直接相互作用（圖3c）。與正常結(jié)腸細(xì)胞系NCM460相比，整合素α2和β1在結(jié)直腸癌細(xì)胞（HT-29、Caco-2和SW48）中過(guò)表達(dá)。我們的研究結(jié)果表明厭氧消化鏈球菌表面蛋白PCWBR2可以通過(guò)整合素α2/β1與結(jié)腸細(xì)胞直接相互作用，尤其是在表達(dá)這些受體蛋白的結(jié)直腸癌細(xì)胞中。

圖3  厭氧消化鏈球菌通過(guò)與上皮細(xì)胞表面受體整合素α2/β1相互作用附著在結(jié)腸細(xì)胞上

 

厭氧消化鏈球菌通過(guò)整合素α2/β1和PCWBR2附著于結(jié)直腸癌細(xì)胞

接下來(lái)，我們研究了PCWBR2-整合素α2/β1在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的作用。由于細(xì)菌附著是結(jié)腸上皮定植的必要條件，我們首先探討厭氧消化鏈球菌附著是否依賴于PCWBR2和整合素α2/β1之間的相互作用。為了研究厭氧消化鏈球菌在結(jié)腸細(xì)胞系中的附著是否依賴于PCWBR2與整合素α2/β1的互作，用整合素抑制劑RGDS肽對(duì)4株結(jié)腸細(xì)胞系（HT-29、Caco-2、SW48和NCM460）進(jìn)行了細(xì)菌附著試驗(yàn)。在所有四種細(xì)胞系中，RGDS以劑量依賴的方式抑制厭氧消化鏈球菌附著（圖3d）。與這些發(fā)現(xiàn)一致，小干擾RNA介導(dǎo)了HT-29、Caco-2、SW48和NCM460細(xì)胞中整合素α2和β1的敲除（圖3f），并減少了厭氧消化鏈球菌的附著（圖3e）。用抗體阻斷整合素α2和β1也可減少厭氧消化鏈球菌對(duì)這些細(xì)胞系的附著（圖3g）。這些結(jié)果表明，PCWBR2通過(guò)整合素α2/β1介導(dǎo)厭氧芽孢桿菌的粘附。

圖3  厭氧消化鏈球菌通過(guò)與上皮細(xì)胞表面受體整合素α2/β1相互作用附著在結(jié)腸細(xì)胞上

厭氧消化鏈球菌通過(guò)PCWBR2-整合素α2/β1相互作用促進(jìn)PI3K-Akt-NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

厭氧消化鏈球菌增加了HT-29、Caco-2和SW48細(xì)胞系的細(xì)胞增殖。為了探討整合素α2/β1下游的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，我們對(duì)與厭氧消化鏈球菌共培養(yǎng)的HT-29和Caco-2細(xì)胞系進(jìn)行了基因表達(dá)譜分析。厭氧消化鏈球菌處理后HT-29和Caco-2細(xì)胞的RNA測(cè)序（RNA-seq）結(jié)果顯示，與厭氧消化鏈球菌共培養(yǎng)后，兩個(gè)細(xì)胞系中244個(gè)基因（q<0.25）持續(xù)上調(diào)。在上調(diào)的基因中，Itga2和Itgb1被鑒定，進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)了它們?cè)趨捬跸溓蚓倌[瘤作用中的潛在作用?；蚣患治鲲@示厭氧消化鏈球菌介導(dǎo)的基因表達(dá)與活性氧途徑、頂端連接途徑、PI3K-Akt-mTOR信號(hào)和膽固醇穩(wěn)態(tài)有關(guān)。整合素是頂端連接通路的關(guān)鍵成分，它通過(guò)誘導(dǎo)黏著斑激酶（FAK）磷酸化，進(jìn)而使PI3K的p85亞基磷酸化。因此，我們假設(shè)厭氧消化鏈球菌通過(guò)PCWBR2-整合素α2/β1互作從而激活PI3K-Akt途徑進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，我們檢測(cè)了參與PI3K-Akt級(jí)聯(lián)的基因的信使RNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)PI3K-Akt途徑中關(guān)鍵基因包括Itga2、Itgb1、Pi3kr1、Akt1、Nfkb1在用厭氧消化鏈球菌處理的HT-29、Caco-2和SW48細(xì)胞中顯著上調(diào)。相應(yīng)地，通過(guò)western blot檢測(cè)到整合素α2/β1、FAK、磷酸化FAK（P-FAK）、PI3K（p85）、P-PI3K（p85）、Akt、P-Akt、NF-κB p65（RelA）和p-p65的蛋白表達(dá)也增加（圖4a）。增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）是一種細(xì)胞增殖標(biāo)志物，也被厭氧消化鏈球菌誘導(dǎo)。

而與整合素抑制劑RGDS肽（圖4a）、整合素α2/β1小干擾RNA（圖4b）或整合素α2/β1抗體（圖4c）聯(lián)合處理則可消除厭氧消化鏈球菌誘導(dǎo)的整合素α2/β1-PI3K-Akt-p65信號(hào)級(jí)聯(lián)和PCNA蛋白表達(dá)。我們的研究結(jié)果表明，厭氧消化鏈球菌通過(guò)PCWBR2整合素α2/β1相互作用促進(jìn)PI3K-Akt-NF-κB信號(hào)傳導(dǎo)。

圖4 厭氧消化鏈球菌介導(dǎo)整合素β1/α2信號(hào)激活Pi3K-Akt途徑促進(jìn)體外細(xì)胞增殖，這些作用在Apc^Min/+小鼠模型中得到驗(yàn)證。

 

厭氧消化鏈球菌激活Apc^Min/+小鼠的整合素α2/β1-PI3K-Akt-NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)

接下來(lái)，我們?cè)噲D驗(yàn)證厭氧消化鏈球菌對(duì)模型鼠信號(hào)級(jí)聯(lián)的影響。對(duì)用厭氧消化鏈球菌處理的模型鼠結(jié)腸腫瘤的qPCR分析顯示厭氧消化鏈球菌處理的腫瘤中Itga2、Itgb1、Akt1和Nfkb1顯著上調(diào)（圖4d）。此外，整合素α2、整合素β1、PI3K（p85）、P-PI3K、Akt、P-Akt、NF-κB p65和P-NF-κB p65的蛋白表達(dá)均在厭氧消化鏈球菌處理的模型鼠的腫瘤中上調(diào)（圖4e）。這些信號(hào)級(jí)聯(lián)的激活是必然的，厭氧消化鏈球菌處理的模型鼠腫瘤顯示細(xì)胞增殖增加，這一點(diǎn)可以從PCNA蛋白表達(dá)（圖4e）和Ki-67⁺細(xì)胞（圖4f）高于對(duì)照處理組腫瘤得到證明。這些結(jié)果與體外觀察結(jié)果基本一致，從而證實(shí)厭氧消化鏈球菌在體內(nèi)激活了整合素α2/β1-PI3K-Akt-NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)。

圖4 厭氧消化鏈球菌介導(dǎo)整合素β1/α2信號(hào)激活Pi3K-Akt途徑促進(jìn)體外細(xì)胞增殖，這些作用在Apc^Min/+小鼠模型中得到驗(yàn)證。

厭氧消化鏈球菌增加Apc^Min/+小鼠促炎細(xì)胞因子的表達(dá)

我們研究了厭氧消化鏈球菌誘導(dǎo)結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制。我們用PCR技術(shù)分析了厭氧消化鏈球菌處理后模型小鼠結(jié)腸腫瘤炎癥反應(yīng)和自身免疫的84個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)。厭氧消化鏈球菌上調(diào)了大多數(shù)炎癥相關(guān)基因（60），只有2個(gè)基因被下調(diào)（圖5a）。我們觀察到在厭氧消化鏈球菌處理后模型小鼠結(jié)腸腫瘤中與骨髓源性抑制細(xì)胞（MDSCs）（Il10、Ifng、Csf1、Il6、Ptgs2和Nfkb1）、腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）（Ccl17、Ccl22、Il1r1、Il1a、Cxcl10和Tnf）和腫瘤相關(guān)中性粒細(xì)胞（TAN）（Cxcl1、Cxcl2、Cxcl5、Tnf、Il17a）相關(guān)的免疫標(biāo)記基因的強(qiáng)烈上調(diào)，確認(rèn)細(xì)胞因子上調(diào)，如Il10、Ifng（圖5b）和Nfkb1（圖4d）。綜上所述，表明厭氧消化鏈球菌可以誘導(dǎo)結(jié)直腸癌的促炎癥反應(yīng)，這與特定腫瘤浸潤(rùn)免疫細(xì)胞群的富集有關(guān)。

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圖5厭氧消化鏈球菌改變腫瘤免疫微環(huán)境促進(jìn)結(jié)直腸癌。

厭氧消化鏈球菌改變腫瘤免疫微環(huán)境促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)生

為了直接探討厭氧消化鏈球菌對(duì)結(jié)直腸癌腫瘤免疫微環(huán)境的影響，我們使用多色流式細(xì)胞術(shù)（圖5c）分析了從Apc ^Min/+小鼠結(jié)腸分離的腫瘤浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞的組成。與qPCR結(jié)果一致，我們觀察到，與對(duì)照PBS處理的Apc ^Min/+小鼠相比，厭氧消化鏈球菌處理的Apc ^Min/+小鼠中MDSCs、TAMs和粒細(xì)胞TANs顯著富集（圖5c）。MDSCs是具有免疫抑制活性的腫瘤容許性髓細(xì)胞，我們進(jìn)一步分析了兩個(gè)亞群的MDSCs，單核MDSCs（M-MDSCs）和粒細(xì)胞MDSCs（G-MDSCs）；兩個(gè)亞群在厭氧消化鏈球菌處理的小鼠中均比對(duì)照組增加（圖5c）。M-MDSCs主要產(chǎn)生一氧化氮，是TAMs的前體，而G-MDSCs則產(chǎn)生活性氧，并能分化為GTANs,因此我們分析了TAMs，包括M₂ like-TAMs和GTANs；結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，厭氧消化鏈球菌處理的小鼠TAMs和GTANs都得到了富集（圖5c）。厭氧芽孢桿菌處理的模型小鼠的腫瘤浸潤(rùn)性細(xì)胞毒性T細(xì)胞略有增加（圖5c）。我們還觀察到，與對(duì)照組相比，厭氧消化鏈球菌處理的模型小鼠的調(diào)節(jié)性T（Treg）細(xì)胞和輔助性T17（T_h 17）細(xì)胞增加。Treg和T17細(xì)胞與腸道炎癥和CRC以及IL-23和IL-10水平高度相關(guān)，這兩種細(xì)胞在厭氧消化鏈球菌處理的模型小鼠中均上調(diào)（圖5a）。

阻斷整合素α2/β1可減弱厭氧消化鏈球菌對(duì)Apc ^Min/+小鼠的促腫瘤和信號(hào)傳導(dǎo)作用

為了驗(yàn)證PCWBR2整合素α2/β1相互作用在厭氧消化鏈球菌對(duì)模型小鼠促腫瘤作用中的作用，我們通過(guò)腹腔注射RGDS肽（每只小鼠200微克，每周三次，持續(xù)10周）來(lái)阻斷整合素α2/β1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)RGDS肽顯著降低了用厭氧消化鏈球菌處理的模型小鼠的結(jié)腸腫瘤數(shù)量和體重（圖6a）。RGDS肽對(duì)對(duì)照小鼠無(wú)明顯影響，提示整合素α2/β1在無(wú)厭氧消化鏈球菌的情況下不促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

圖6  阻斷整合素β1/α2-減弱厭氧消化鏈球菌相關(guān)Apc^Min/+小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生

在模型小鼠中厭氧消化鏈球菌上調(diào)的PI3K-Akt途徑基因，包括Itga2、Itgb1、Akt1和Nfkb1則被RGDS肽處理（圖6b）阻止。此外，RGDS肽下調(diào)了厭氧消化鏈球菌處理的模型小鼠腫瘤中整合素α2、整合素β1、PI3K（p85）、p-PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65和PCNA的蛋白表達(dá)（圖6c）。

圖6  阻斷整合素β1/α2-減弱厭氧消化鏈球菌相關(guān)Apc^Min/+小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生

RGDS肽治療逆轉(zhuǎn)了厭氧消化鏈球菌對(duì)模型小鼠腫瘤細(xì)胞增殖（Ki-67）的影響（圖6d）。除了腫瘤的內(nèi)在反應(yīng)外，RGDS肽還降低了厭氧消化鏈球菌相關(guān)的促炎因子水平，如Nfkb1（圖6b）、Il10和Ifng（圖6e）。為了證實(shí)炎癥在厭氧消化鏈球菌促進(jìn)結(jié)腸腫瘤發(fā)生中的作用，用環(huán)氧合酶-2抑制劑塞來(lái)昔布治療小鼠，塞來(lái)昔布顯著降低了Apc ^Min/+小鼠中厭氧消化鏈球菌誘導(dǎo)的結(jié)腸腫瘤數(shù)量和體重。總之，研究發(fā)現(xiàn)證實(shí)了整合素α2/β1-PI3K-Akt-NF-κB信號(hào)級(jí)聯(lián)在厭氧消化鏈球菌介導(dǎo)的Apc^Min/+小鼠結(jié)直腸癌發(fā)生中的潛在作用。

圖6  阻斷整合素β1/α2-減弱厭氧消化鏈球菌相關(guān)Apc^Min/+小鼠結(jié)腸腫瘤的發(fā)生