天昊生物微生物項(xiàng)目新文：沸石-納米零價(jià)鐵復(fù)合材料對農(nóng)田土壤中鎘、鉛、砷的固定化：封存機(jī)制與微生物響應(yīng)

發(fā)稿時(shí)間：2020-03-03來源：天昊生物

 

浙江大學(xué)環(huán)境與資源學(xué)院近期在環(huán)境科學(xué)與生態(tài)學(xué)TOP期刊《Environmental Pollution》上發(fā)表了關(guān)于沸石-納米零價(jià)鐵復(fù)合材料對農(nóng)田土壤中鎘、鉛、砷的固定化：封存機(jī)制與微生物響應(yīng)的研究文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的相對定量擴(kuò)增子測序工作。在恭喜客戶發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

 

英文題目：Zeolite-supported nanoscale zero-valent iron for immobilization of cadmium, lead, and arsenic in farmland soils: Encapsulation mechanisms and indigenous microbial responses

中文題目：沸石-納米零價(jià)鐵復(fù)合材料對農(nóng)田土壤中鎘、鉛、砷的固定化：封存機(jī)制與微生物響應(yīng)

期刊名：Environmental Pollution

5年平均影響因子：6.1

研究概要：

沸石-納米零價(jià)鐵復(fù)合材料（Z-NZVI）具有很大的金屬去除潛力，但其在實(shí)際土壤系統(tǒng)中的包埋機(jī)理和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)尚不完全清楚。我們進(jìn)行了長期培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)，以期對自然污染農(nóng)田土壤中金屬（鎘、鉛、砷）與Z-NZVI之間的相互作用以及土壤修復(fù)過程中土著細(xì)菌群落的變化有新的認(rèn)識。具有pH調(diào)節(jié)和吸附能力，30g kg ^-1 z-NZVI能顯著降低了土壤有效金屬濃度10.2-96.8%，180d后在酸性和堿性土壤中轉(zhuǎn)化為強(qiáng)結(jié)合組分。對土壤中的Z-NZVI進(jìn)行了創(chuàng)新性的磁選，并進(jìn)行了XRD和XPS表征，結(jié)果表明，B型三元絡(luò)合物、非均相共沉淀和/或同時(shí)發(fā)生的金屬氧化還原反應(yīng)，特別是Cd₃（AsO₄）₂、PbFe ₂（AsO ₄）₂（OH）₂和As⁰的形成，僅在特定土壤條件下發(fā)生。16S擴(kuò)增子測序表明，添加Z-NZVI后，耐鐵/敏感細(xì)菌、pH敏感細(xì)菌、反硝化細(xì)菌和耐金屬細(xì)菌的暫時(shí)變化最終被消除，因?yàn)橥寥捞匦酝苿恿吮就良?xì)菌群落的重建。同時(shí)，Z-NZVI恢復(fù)了土壤細(xì)菌DNA復(fù)制和反硝化功能的基本活性。這些結(jié)果證實(shí)了Z-NZVI在無明顯生態(tài)毒性的情況下，對重金屬污染農(nóng)田土壤的長期修復(fù)具有一定潛在應(yīng)用價(jià)值。

研究背景：

隨著工業(yè)化和現(xiàn)代化進(jìn)程的加快，世界范圍內(nèi)的農(nóng)業(yè)土壤金屬污染日趨嚴(yán)重。在不同的人為來源中，采礦和冶煉通常是主要來源?？刂苾?yōu)先的共存污染物As、Cd、Pb在污染農(nóng)田土壤中的生物有效性和遷移率均顯著高于其它金屬。金屬在土壤-作物系統(tǒng)中遷移轉(zhuǎn)化后，通過食物鏈進(jìn)行生物放大，對人體造成內(nèi)臟損傷和免疫系統(tǒng)疾病等健康風(fēng)險(xiǎn)。因此開發(fā)修復(fù)技術(shù)降低污染區(qū)金屬的毒性成為研究熱點(diǎn)。

鑒于其成本效益，土壤改良劑包括生物炭、氧化鐵、粘土礦物和鈣質(zhì)材料已廣泛用于原位固定和轉(zhuǎn)化不穩(wěn)定金屬為固體。石灰對土壤中Cd、Pb有很好的吸附能力，但隨著土壤pH值的增加，石灰對As的遷移有促進(jìn)作用，而Fe（III）-生物炭對As污染土壤的吸附則會導(dǎo)致土壤酸化作用而活化Cd。因此，篩選合適的改良劑對于在不增加額外風(fēng)險(xiǎn)的情況下修復(fù)金屬污染的農(nóng)田土壤至關(guān)重要。

由于納米零價(jià)鐵（NZVI）及其復(fù)合材料具有低成本、高活性的特點(diǎn)，在以陽離子金屬和陰離子類金屬共存為目標(biāo)的情況下，它們被優(yōu)先使用。NZVI具有獨(dú)特的核殼結(jié)構(gòu)，可以分別通過零價(jià)鐵心和氫氧化鐵殼作為電子供體和吸附劑。由于NZVI顆粒進(jìn)入環(huán)境后會立即聚集，因此提出了用天然沸石等環(huán)?；|(zhì)分散NZVI的方法。天然沸石具有多個陽離子結(jié)合位點(diǎn)和介孔結(jié)構(gòu)，可以減少裸NZVI的聚集，提高其修復(fù)效率。然而，目前的研究主要集中在沸石負(fù)載的NZVI（Z-NZVI）對地下水的凈化，而忽略了土壤中天然金屬的污染。同時(shí)，許多研究揭示了Z-NZVI與金屬離子之間的相互作用，但在不同土壤條件下（如pH值）的具體反應(yīng)過程卻很少被探索。由于缺乏實(shí)用的分離技術(shù)，改性劑與土壤污染物反應(yīng)后的表征受到限制。幸運(yùn)的是，從土壤中磁選出的Z-NZVI復(fù)合材料可以用來研究固定化污染物的價(jià)態(tài)和礦物相。因此，可以逐一確定可能的機(jī)制。Z-NZVI一旦被引入土壤，必然會影響土壤生態(tài)系統(tǒng)中本地微生物的活性和行為。在相同的NZVI濃度下，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌具有更強(qiáng)的耐藥性，這是由于前者細(xì)胞壁較硬。通過盆栽試驗(yàn)，有研究證實(shí)NZVI引起的氧化脅迫可抑制金屬污染土壤中叢枝菌根真菌的發(fā)育和功能。將裸露的或包被的NZVI與鐵還原、鐵氧化和反硝化過程耦合，可以促進(jìn)某些功能菌（如Shewanella、Sediminibacterium和Bacteroides）的生長。因此，有必要評估Z-NZVI對本地微生物的長期影響，以填補(bǔ)其在土壤生態(tài)系統(tǒng)中應(yīng)用風(fēng)險(xiǎn)研究方面的空白。

本研究的假設(shè)是，長期施用Z-NZVI可通過多組分絡(luò)合和共沉淀同時(shí)固定酸性和堿性農(nóng)田土壤中的As、Cd和Pb，且無明顯的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)。采用創(chuàng)新的磁選設(shè)計(jì)，結(jié)合顯微光譜法和分子生物學(xué)技術(shù)，為土壤修復(fù)過程中次生礦物Z-NZVI及其相關(guān)微生物反應(yīng)提供重要信息。本研究的目的是：（1）合成Z-NZVI復(fù)合材料并確定其在酸性和堿性土壤中固定金屬的持久性；（2）表征原始和分離的Z-NZVI的表面組分，闡述其封存機(jī)制；（3） 診斷改良劑對本地細(xì)菌群落和功能基因表達(dá)的影響（例如反硝化和生物活性基因）；（4）評估Z-NZVI在土壤修復(fù)中的綜合環(huán)境效益。

研究方法：

土壤取樣和預(yù)處理：

從我國南方和北方采集了兩種pH值在5.12～7.93之間的重金屬污染農(nóng)田土壤。酸性和堿性土壤采樣點(diǎn)分別位于河南省上虞市和濟(jì)源市鉛鋅礦區(qū)及有色冶煉廠周圍。這些土壤中的總砷、鎘和鉛含量嚴(yán)重超過中國農(nóng)用地二級標(biāo)準(zhǔn)（NEPA，2018）

改良劑準(zhǔn)備：

所有化學(xué)品和試劑均為試劑級，所有溶液均用超純水配制。采用液相還原法合成了Z-NZVI復(fù)合材料，簡單地說，沸石粉（48.0 g）和400 毫升 0.240M六水三氯化鐵溶液混合，在2升三頸燒瓶中加入400毫升0.960M硼氫化鈉溶液，在好氧條件下連續(xù)還原。機(jī)械攪拌1小時(shí)后，用磁鐵從混合物溶液中分離出Z-NZVI復(fù)合材料，用超純水洗滌三次去除可溶性雜質(zhì)，然后在60℃真空干燥。復(fù)合材料中NZVI的含量約為10.0%（w/w）。

土培實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

根據(jù)先前的研究，0、10和30 g kg^-1沸石和Z-NZVI在裝入塑料罐之前，與酸性和堿性土壤充分混合。5個處理如下：對照組（CK）；10 g kg^-1或30g kg^-1個沸石處理（Z1、Z3）；10 g kg^-1或30 g kg^-1 Z-NZVI處理（N1，N3）。三次重復(fù)，每次處理1.50kg的樣品恒定含水量70.0%（25度）。這些罐子上覆蓋著多孔塑料薄膜，以確保通風(fēng)和減少水分損失。培養(yǎng)1、3、7、15、30、60、120和180d后，從每個培養(yǎng)罐中采集100g亞樣本，其中90.0g用于理化分析，10.0g用于生物信息學(xué)分析。

 

改良土壤分析：

新鮮亞樣本經(jīng)凍干、篩分后進(jìn)行理化分析。用相應(yīng)的電極分別測定了1:2.5（w/v）和1:5（w/v）土壤水懸浮液的pH值和電導(dǎo)率。以1:5（w/v）的土水比用去離子水提取溶解有機(jī)碳（DOC），然后過濾用于總有機(jī)碳分析。用0.100M CaCl₂萃取土壤有效態(tài)Cd、Pb和Fe，用0.500M NaHCO ₃萃取土壤有效態(tài)As。采用BCR順序萃取法，研究了亞樣品中As、Cd和Pb的組分，包括酸溶組分、還原組分、氧化組分和殘留組分。另外，還分別提取了金屬的水溶性部分。所有提取物均經(jīng)0.45微米膜過濾，并采用電感耦合等離子體質(zhì)譜進(jìn)行分析。

磁分離與改性劑的表征：

從30 g kg^-1 Z-NZVI處理罐中分別在30和120天取50.0g亞樣，冷凍干燥和磁性分離。將分離出的磁性材料研磨（<0.16mm）并再次進(jìn)行磁性分離，以確保Z-NZVI的純度。用X射線衍射儀和X射線光電子能譜儀對Z-NZVI合金在使用前后的礦物相組成和原子價(jià)態(tài)進(jìn)行了表征。利用掃描電子顯微鏡結(jié)合能量色散X射線和傅里葉變換紅外光譜分析了改性劑表面的微觀形貌、元素含量和官能團(tuán)。

 

16S擴(kuò)增子測序和實(shí)時(shí)定量PCR：

采用16S擴(kuò)增子測序和實(shí)時(shí)定量PCR（RT -qPCR）技術(shù)，研究了亞樣本中本地細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和功能基因表達(dá)。

 

部分研究結(jié)果：

本土細(xì)菌群落的反應(yīng)

在門和屬水平上觀察到細(xì)菌的相對豐度，以顯示在土壤修復(fù)過程中修復(fù)對本地細(xì)菌群落的影響（圖7）。盡管添加Z-NZVI（1-15 d）后，酸性和堿性土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生了顯著變化，在10或30 g kg^-1 Z-NZVI處理下，群落Shannon-Wiener多樣性指數(shù)略有增加或減少(P > 0.05)（圖S8），排除了Z-NZVI在好氧培養(yǎng)期間由于無毒氧化產(chǎn)物（FeOOH/Fe₂O₃）和金屬去除而產(chǎn)生的廣譜生態(tài)毒性。

在對照組（圖7a和b）中，占門水平細(xì)菌群落總豐度72.5%以上的優(yōu)勢菌門（包括Firmicutes、Proteobacteria、Acidobacteria、Actinobacteria、Gemmatimonadetes）的相對豐度在短期暴露于Z-NZVI后發(fā)生了明顯變化。在經(jīng)Z-NZVI處理的土壤中，屬于Firmicutes的優(yōu)勢屬Bacillus、Paenibacillus、Alicyclobacillus的相對豐度顯著增加（圖7c和d），這是由于它們的抗鐵性和土壤pH值的增加。已有研究證明Bacillus促進(jìn)了鐵（III）還原，并在NZVI層周圍富集，可將鐵和金屬重新分配到更穩(wěn)定的鐵礦物相中。然而Z-NZVI對革蘭氏陰性菌Xanthomonadaceae、Massilia、Lysobacter（隸屬于Proteobacteria）的生長有抑制作用，因?yàn)樗鼈兊募?xì)胞壁沒有肽聚糖層。在酸性條件下，酸桿菌屬Acidobacteria的Acidipila、Gp14、Gp6和Gp4都受到pH調(diào)節(jié)劑的抑制，并且共生屬（Subdivision 3）在堿性土壤中的相對豐度降低（圖7d）。相比之下，放線菌門Actinobacteria的Gaiella，Arthrobacter以及芽單胞菌門Gemmatimonadetes的Gemmatimonas被鑒定為鐵氧化和反硝化細(xì)菌，其生長刺激得益于電子供體Z-NZVI在兩種土壤中的作用。這些生物電子受體可以加速Fe⁰的氧化，影響Z-NZVI在金屬固定化中的效率，無論是正的還是負(fù)的。

圖7 金屬污染的酸性和堿性土壤中的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)（a-b）（門）和（c-d）（屬）

隨著Fe（III）的再固定化，細(xì)菌群落的主成分分析（PCA）展現(xiàn)了時(shí)間尺度上的相似樣本簇，因此，Z-NZVI的干擾最終被消除（180 d）（圖S9）。

圖S9 細(xì)菌群落間差異的主成分分析（PCA）

與酸性土壤相比，堿性土壤由于Z-NZVI對其理化性質(zhì)的干擾較小，細(xì)菌群落間的系統(tǒng)發(fā)育差異較小。環(huán)境因子與優(yōu)勢屬豐度（>1.00%）之間的皮爾遜相關(guān)分析如熱圖（圖8）所示。pH、EC和DOC作為土壤的主要理化性質(zhì)，決定著土壤中污染物和養(yǎng)分的有效性和遷移性，因此它們與大多數(shù)優(yōu)勢屬有著密切的相互作用（P<0.05）。只有Sphingomonas、Lysobacter、Terrimonas等攜帶金屬抗性基因的特定屬分別與有效Pb、Cd、As濃度呈顯著正相關(guān)（P<0.05），因此在金屬固定化后，由于失去了生存優(yōu)勢，它們的相對豐度降低。結(jié)合冗余分析（圖S10），發(fā)現(xiàn)Z-NZVI對pH、EC和DOC的影響，而不是金屬（loid）的可用性，是重建本地細(xì)菌群落的關(guān)鍵驅(qū)動因素。

 

 圖8 優(yōu)勢屬豐度（>1.00%）與環(huán)境因子的Pearson相關(guān)分析的熱圖（P<0.05；**P<0.01）。

 

圖S10  環(huán)境因子對本地細(xì)菌群落影響的冗余分析：（a）酸性土壤；（b）堿性土壤。

功能基因的反應(yīng)

基于RT-qPCR分析，通過比較處理組和對照組，計(jì)算功能基因（gyrA、narG和nirS）的相對表達(dá)水平（圖S11）。由于Z-NZVI通過降低金屬的有效性改善了細(xì)菌的棲息地，因此gyrA基因（編碼DNA回旋酶）在酸性和堿性土壤中的相對表達(dá)水平增加了約10.3倍和19.7倍，這與刺激所有細(xì)菌的DNA復(fù)制相對應(yīng)（圖S11a-b）。在添加Z-NZVI的酸性和堿性土壤中，narG和nirS基因（編碼硝酸鹽和亞硝酸鹽還原酶）的相對表達(dá)水平增加了2.14-3.54和5.63-6.18倍（圖S11c-f），這是因?yàn)橛捎趬A性土壤中的反硝化細(xì)菌（包括Gemmaticonas、Arthrobacter和Gaiella）的細(xì)菌豐度（9.55%）高于酸性土壤（2.10%）。此外，Z-NZVI對反硝化過程的促進(jìn)作用在酸性土壤中比在堿性土壤中持續(xù)時(shí)間短，因?yàn)樗嵝詶l件加速了NZVI的氧化和電子轉(zhuǎn)移。因此，長期施用Z-NZVI可以改善土壤質(zhì)量，恢復(fù)當(dāng)?shù)丶?xì)菌的某些生態(tài)功能。

圖S11 RT-qPCR測定酸性土壤（a，c，e）和堿性土壤（b，d，f）中功能基因表達(dá)（gyrA，narG和nirS）。