新年開篇！天昊生物微生物項目文章登陸《Biology and Fertility of Soils》

發(fā)稿時間：2020-02-19來源：天昊生物

南京農業(yè)大學近期在土壤學領域一區(qū)雜志《Biology and Fertility of Soils》上發(fā)表了關于8年施氮對小麥根際細菌群落遺傳效應的研究文章。在這項研究中天昊生物有幸承擔了樣品的相對定量擴增子測序工作。在恭喜客戶發(fā)表文章同時，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Legacy effects of 8-year nitrogen inputs on bacterial assemblage in wheat rhizosphere中文題目：8年施氮對小麥根際細菌群落的遺傳效應期刊名：Biology and Fertility of Soils影響因子：4.829

研究概要

本研究主要探討8年施氮（以0、140、280、470和660kg N ha?1 year?1為梯度）對小麥根際細菌群落多樣性、相互作用和組裝過程的影響。根際細菌α-多樣性隨歷史施氮量的增加而增加，但在施氮量超過280kg N ha?1 year?1時，根際細菌α-多樣性沒有變化。歷史施氮量明顯改變了根際細菌群落組成，施氮量大的土壤與不施氮的土壤差異較大。最接近相對指數（NRI）和最接近分類單元指數（NTI）分析表明，大多數樣品的根際細菌群落是系統(tǒng)聚類的，高氮處理（>470 kg N ha?1 year?1）比低氮處理（<140 kg N ha?1 year?1）表現(xiàn)出更高的聚類水平，表明歷史氮輸入越高，土壤環(huán)境選擇壓力越大。小麥地上生物量的增加伴隨著共生網絡規(guī)模和連接性的增大?？傮w而言，隨著歷史氮輸入的增加，所產生的遺留效應迫使根際細菌群落承受更高的環(huán)境選擇壓力，并在隨后的作物生長過程中間接影響小麥根際組合的復雜性。

研究背景

氮（N）肥是限制植物和微生物生長的重要營養(yǎng)物質之一，在全球范圍內被供應到陸地生態(tài)系統(tǒng)中，自工業(yè)革命以來，由于人類活動的結果，氮的輸入率翻了一番。在我國集約農業(yè)地區(qū)，相當數量的氮（550-600 kg N ha?1 year?1）直接施入農田土壤。氮素的富集會影響土壤微生物群落的組成和功能，隨著群落組成的變化，微生物多樣性和呼吸作用降低，主要受土壤pH、有機碳和總氮含量的變化驅動。除了對土壤微生物的影響外，施氮還增加了與植物相關的凋落物C和根際沉積物C。由于長期施用肥料而引起的土壤變化稱為遺留物或殘留物，即使停止施肥，也可能在隨后的季節(jié)產生持續(xù)效應（稱為遺留效應）。先前的研究表明，先前的植物作物類型和土地利用歷史對微生物群落組成和多樣性具有遺留影響，然而，目前還缺乏對長期施氮對微生物多樣性影響的研究。根際是植物根系周圍的毫米級區(qū)域，是絕大多數活性微生物的棲息地，因此也是微生物相互作用的熱點。根際微生物以根系分泌物為食，被認為是植物表型的一部分，在功能生態(tài)學中起著關鍵作用過程，如獲取植物養(yǎng)分，凋落物分解，保護土壤健康。研究發(fā)現(xiàn)植物的種類、基因型和發(fā)育階段可以改變根際微生物的群落組成和多樣性，從而影響土壤功能。此外，土壤鹽分和pH值等理化性質的變化也會對根際微生物群落產生影響。因此，了解根際細菌群落對長期施氮遺留效應的響應是非常重要的。

以前在研究根際群落時，主要采用了基于分類單元和功能的方法，然而，細菌系統(tǒng)發(fā)育可能提供更多關于基于性狀的群落組裝的信息，群落組裝過程包括確定性過程（例如，系統(tǒng)發(fā)育聚類和系統(tǒng)發(fā)育過度擴散）和隨機過程（例如，概率擴散和生態(tài)漂移）。環(huán)境過濾會導致物種的親緣關系比預期的更為密切（系統(tǒng)發(fā)育聚類），而競爭性排斥則會導致親緣關系不太密切的物種（系統(tǒng)發(fā)育過度分散）。一些研究表明，在細菌群落中，確定性過程占主導地位，隨著海拔、鹽度梯度、極端酸性或堿性條件的增加，系統(tǒng)發(fā)育聚類增加，觀察到的群落聚集模式也取決于它們是在大空間尺度上進行檢查還是在精細空間尺度上進行檢查。目前，韋伯等人提出了基于零模型的群落組合系統(tǒng)發(fā)育結構分析方法，即觀察到的平均成對系統(tǒng)發(fā)育距離（MPD）和平均最近分類單元距離（MNTD）分別與零模型期望值進行比較，這種方法為識別群落組裝過程提供了一種很有前途的選擇。

微生物群落組裝的生態(tài)過程不僅包括環(huán)境因素引起的系統(tǒng)發(fā)育群落結構的變化，還包括微生物間的相互作用。這些關系可以包括積極的（如互惠）、消極的（如競爭）和中立的關系。微生物之間的相互作用對土壤養(yǎng)分循環(huán)和作物健康具有潛在的影響。共生網絡分析為探索微生物間相互作用對環(huán)境的響應提供了有力的工具。同時，網絡分析可以用來識別支持微生物群落功能和穩(wěn)定性的關鍵物種；例如，在底土中，一些關鍵屬的消失可能導致群落破碎。因此，通過共現(xiàn)網絡分析研究微生物的相互作用，有助于了解不同環(huán)境下群落聚集的基本原理，識別群落中可能存在的關鍵類群。

潛在地，確保有益的微生物群落組合有助于優(yōu)化農業(yè)管理，提高小麥生產力，從而改善糧食安全。我們假設長期的氮輸入會對根際細菌群落的組裝模式和相互作用產生遺留效應，并且這種效應強度會隨著歷史氮輸入率的變化而變化。因此，我們試圖回答以下問題：（1）輸入8年氮梯度后的遺留物如何影響根際細菌群落的組成？（2）哪些生態(tài)過程塑造了受長期施氮遺留效應影響的根際細菌群落？（3）根際微生物間的相互作用是否受歷史氮梯度的調節(jié)？本研究通過優(yōu)化作物在下一季的施氮量為可持續(xù)農業(yè)中微生物介導的土壤特性管理提供了依據。

研究方法

土壤取樣與試驗設計：

在中期定位試驗場，以冬小麥、夏水稻的輪作為主，采集了不同施氮量的土壤，從2010年開始實施現(xiàn)場試驗。試驗采用隨機區(qū)組設計：3個重復，5個氮肥處理，歷史施氮8年，每年施氮量分別為：0、140、280、470、660 kg N ha?1（以下分別為N0、N140、N280、N470、N660），栽培冬小麥和夏水稻。在整個試驗過程中，尿素供氮，過磷酸鈣供磷，氯化鉀供鉀。2017年小麥開花期，采用固體細溝采樣器（內徑3cm）和隨機取樣方法，從每個處理區(qū)0-20cm土層中采集土壤5kg，風干土樣用不銹鋼網（<5mm）過篩，每種氮處理的土樣分別用聚乙烯袋充分混合。盆栽試驗前測定了各處理的土壤理化性質。

將土壤填入聚丙烯盆中（高度×直徑，10 cm×12 cm），土壤約500 g干重，進行了16個重復的微觀實驗，以盡量減少重復之間的變異性，本研究共安排80盆（5次施氮量×16次重復）。將盆栽置于玻璃溫室中，每天12小時，平均氣溫25°C，在盆上播種小麥，每天用自來水澆水，保持土壤水分在20%左右。為了消除肥料對土壤微生物和植物的干擾，研究歷史氮素輸入對土壤微生物和植物的遺傳效應，在整個植物生長期不施肥。

16S擴增子相對定量測序：

在開花期（移栽后8周生長），收集80個盆栽植物，對根際土壤進行采樣。根際土壤樣品的采集方法是將包括根在內的整個小麥植株從土壤中移開，通過抱枝的方式進行劇烈搖動，并將殘留在根表面的土壤視為根際土壤。包括根際土壤的根系立即從植株上切下，轉移到含有10毫升無菌水的無菌離心管中。附著在根表面的土壤通過渦旋和振蕩混合到水中，然后除去根，將裝有懸浮液的管子渦旋5分鐘，11000g離心約5 min，棄上清液，剩余根際土壤部分保存于-20℃，48 h內提取DNA。使用MoBio Powersoil DNA Isolation Kits提取根際土壤DNA，然后進行16S擴增子相對定量測序（V4-V5區(qū)域）。

植物和土壤性質檢測：

將地上植物和根樣品在75℃下烘干，直到獲得用于生物量測量的恒定重量。土壤樣品經風干和篩分進行化學分析，例如測定土壤pH值、有效磷（AP）、有效鉀（AK）、有機碳（SOC），總氮（TN）、堿解氮(Alk-N)等指標。

研究結果

植物生物量與土壤特性

盆栽試驗前，N0處理與其它施氮處理的土壤化學性質存在顯著差異。N0處理土壤AP、AK含量及pH值均顯著高于其它4個施氮處理。長期施氮與不施氮相比，提高了土壤NO3-–N和TN含量。盆栽試驗結束時，各處理間土壤理化性質的差異保持不變（表1）。與其它氮肥處理相比，N0處理的土壤化學性質和植物生物量均表現(xiàn)出顯著差異（表1）。土壤pH值在N0時表現(xiàn)出最大值（pH＝7.47），N660為最低值（pH＝7.25）。四種施氮處理的土壤有機碳SOC和全氮TN含量均高于N0處理。長期施氮增加了土壤Alk-N濃度（從102.13到122.04），顯著降低了土壤有效磷AP（從57.14到38.33）和有效鉀AK（從90.98至64.17）。施氮處理植株總生物量顯著高于N0處理，但施氮處理間差異不顯著。N140、N470和N660處理的地上生物量顯著高于N0處理。雖然不同處理間的根系生物量存在顯著差異，但沒有觀察到一致的趨勢。

表1種植末期各處理土壤理化性質及植物生物量

遺傳效應驅動小麥根際細菌群落的多樣性和差異性

根際細菌Chao1、Shannon和觀測豐富度指數與歷史施氮量顯著相關（圖1）。低氮處理（N0和N140）的樣品多樣性顯著低于高氮處理（N280、N470和N660）。根據擬合模型，Chao1指數、Shannon多樣性和觀測豐富度隨施氮量的增加呈非線性增加（圖1）。

圖1根際土壤細菌α-多樣性在N輸入梯度上的變化，包括Chao1指數（a）、Shannon多樣性（b）和觀測豐富度（c）。

為了評估根際細菌群落的差異（β-多樣性），使用基于Bray-Curtis和加權UniFrac距離的度量來評估群落組成。NMDS圖顯示根際細菌群落在不同施氮量下有明顯的聚集性（圖2）。同時，MRPP、ANOSIM和ADONIS試驗表明，所有處理之間的群落組成存在差異。所有樣本的差異配對比較表明，隨著氮輸入的絕對差異，細菌群落組成（Bray-Curtis距離）和系統(tǒng)發(fā)育（加權UniFrac）距離的差異顯著增加，然而，組內差異沒有顯著變化。

圖2 基于Bray-Curtis距離（a）和加權均勻度（b）的NMDS分析顯示處理間土壤根際細菌群落組成的變化?；诩毦嚯x矩陣的組間MRPP差異檢測。

遺傳效應驅動小麥根際細菌群落組成與功能

為了評價根際細菌群落組成，對30個門進行了高質量序列分析，屬于15個最豐富門（相對豐度>1%）的細菌占所有序列的83.8%，其中變形菌門占從每個樣本獲得的細菌總序列的29.5-48.1%?；谙鄬ωS度和觀測到的OTU的數量，在所有土壤樣品中檢測到優(yōu)勢細菌菌群（變形桿菌、擬桿菌、嗜酸細菌、氯磷菌、厚壁菌和放線菌），但它們的相對豐度變化顯著。然而，在門的水平上，隨著氮的添加，觀察到兩種不同的相對豐度模式，隨著氮輸入速率的增加，Deltaproteobacteria的相對豐度不斷增加，而Verrucomicrobia的相對豐度則相反。在低氮條件下（小于280 kg N ha?1 year?1），某些菌的相對豐度顯著降低或增加，但當氮沉積速率超過280kg N ha?1 year?1時，這些菌則沒有變化，例如Gammaproteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria, Chloroflexi, Gemmatimonadetes，其它細菌在氮梯度上沒有顯示出一致的趨勢。此外，還確定了不同處理間顯著差異的優(yōu)勢屬（相對豐度>1%）。然而，氮處理下優(yōu)勢屬的變化并不總是在門水平上表現(xiàn)出來，例如，屬于Alphaproteobacteria亞門的Rhodobacter和屬于Firmicutes的Bacillus的變化并沒有分別導致Alphaproteobacteria和Firmicutes的一致變化。歷史高氮增加了Gemmatimonas, Gp4, Gp6, Gp7的比例，而降低了Ohtaekwangia, Rhodobacter, Pseudoxanthomonas的比例。

FAPROTAX工具用于將細菌分支（如屬或種）映射到代謝和生態(tài)相關功能，本研究中的細菌可被分配到66個功能群。在預測的功能組中，33個與C、N和S循環(huán)相關的主要功能組被歷史氮輸入顯著改變。歷史高氮輸入與低氮相比，遺留效應導致了與氫營養(yǎng)甲烷化、甲烷化、好氧氨氧化、好氧亞硝酸鹽氧化、硝化作用、硫代硫酸鹽呼吸和暗硫化物氧化相關的功能群的相對豐度較高。在高氮處理（N280、N470和N660）中，與纖維素分解、甲醇氧化、硝酸鹽還原有關的功能群的相對豐度均顯著低于N0和N140處理。此外，N0處理中甲殼分解功能群的相對豐度最大。

氮梯度下根際細菌群落的NRI和NTI

根據零模型分析，與高氮處理（超過280 kg N ha?1 year?1）相關的最接近相對指數（NRI）和最接近分類單元指數（NTI）顯著大于零（圖3）。這表明高氮施用的遺留效應使物種間的親緣關系比預期的更為密切。NTI值顯著大于零與低氮處理（小于280 280 kg N ha?1 year?1）相關（圖3b），而低氮樣品中細菌群落的NRI值與零無顯著差異（圖3a）。這些結果表明，低氮處理根際細菌的系統(tǒng)發(fā)育聚類集中在系統(tǒng)發(fā)育樹的末端，而群落組成的隨機系統(tǒng)發(fā)育模式則發(fā)生在較高層次的樹節(jié)點。

圖3土壤中根際細菌群落的最接近相對指數（NRI）（a）和最接近分類單元指數（NTI）（b）隨氮梯度的變化而變化。正的NRI和NTI值表明群落中的物種比預期的更接近。星號表示NRI（或NTI）值與顯著性水平之間的顯著差異

氮梯度上根際細菌群落共現(xiàn)網絡

采用共生網絡分析方法，研究了小麥根際細菌間潛在的相互作用和生態(tài)位共享。為了進行這一分析，我們基于5個施氮梯度土壤中的序列數據，在屬（和OTU）水平的根際細菌分類群之間構建了5個細菌共生網絡。共生網絡圖顯示了不同處理間的巨大差異（圖4a-e）。根際網絡中基于屬水平的節(jié)點數和連接數在N梯度上是可變的，最小值出現(xiàn)在N0處理中（即，節(jié)點數從N0的92到N660的193，連接數從N0的100到N140的1184）（表2，圖4）。根際網絡節(jié)點數隨地上生物量的增加而單調增加（圖4f）。與高地上生物量相關的根際網絡比與低地上生物量相關的根際網絡包含更多的連接，這表明高地上生物量產生更復雜的網絡模式（連接數量，從100到1184）（圖4a-f）。此外，在OUT水平，共現(xiàn)網絡的節(jié)點和連接的變化與屬水平網絡的變化趨勢相似。綜上所述，隨著土壤肥力的增加，根際細菌網絡隨著地上生物量的增加逐漸變得復雜。

此外，BC反映了一個特定節(jié)點對網絡中其他節(jié)點交互作用的控制程度，BC得分高的屬對維持微生物網絡的連通性有很強的影響。與高地上生物量相關的根際網絡中大多數節(jié)點的BC比與低地上生物量相關的根際網絡中的BC強得多，并且隨著地上生物量的增加，強節(jié)點的數量逐漸增加（圖4f）。觀察到的網絡節(jié)點的BC分布表明，與高地上生物量（N140、N470和N660）相關的多個節(jié)點（例如：Caulobacter, Rhodobacter, Ignavibacterium, Nitrospira）承擔了關鍵的網絡作用，而一些節(jié)點（例如：Sporomusa, Clostridium_III, Bacillus, Tumebacillus, Geobacter）的BC值較低，與地上生物量（N0，N280）相關。細菌群落經過重新排列，在確定整個網絡組成方面賦予了幾個屬以關鍵作用。在與高地上生物量相關的根際共生網絡中，很大一部分節(jié)點定義了網絡拓撲結構，表明更多的屬形成了細菌群落相互作用的模式。