喜訊！天昊生物微生物項(xiàng)目文章登陸《Environmental Pollution》

發(fā)稿時(shí)間：2019-12-26來源：天昊生物

 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所吳黎明研究員課題組的研究成果近期發(fā)表在環(huán)境科學(xué)與生態(tài)學(xué)TOP期刊《Environmental Pollution》上，研究成果發(fā)現(xiàn)烯啶蟲胺干擾腸道微生物群，影響代謝穩(wěn)態(tài)和蜜蜂的免疫力，文章第一作者為該課題組博士后朱麗珍。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的相對定量擴(kuò)增子測序工作。在恭喜客戶發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

 

英文題目：Nitenpyram disturbs gut microbiota and influences metabolic homeostasis and immunity in honey bee (Apis mellifera L.)

中文題目：烯啶蟲胺干擾蜜蜂腸道微生物群，影響代謝穩(wěn)態(tài)和免疫

期刊名：Environmental Pollution

影響因子： 5.714

研究概要：

近年來，新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)和毒性引起了人們的廣泛關(guān)注。然而，新煙堿類殺蟲劑對腸道微生物的影響相關(guān)研究還很有限。在本研究中，將意大利蜜蜂工蜂暴露于亞致死劑量的烯啶蟲胺14天。結(jié)果表明，烯啶蟲胺暴露降低了蜜蜂的存活率和攝食量。此外，16S擴(kuò)增子測序顯示，烯啶蟲胺引起了幾種關(guān)鍵腸道微生物群相對豐度的顯著變化，這幾種腸道微生物菌屬在代謝、免疫等方面發(fā)揮重要作用。使用RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組測序分析，鑒定到526個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)，其中包括代謝、解毒和免疫等過程的功能基因。此外， GO和KEGG的pathway分析表明，烯啶蟲胺影響了幾種生物過程，其中大部分與代謝有關(guān)。總之，這些研究表明，由烯啶蟲胺引起的蜜蜂腸道微生物群失調(diào)可能影響蜜蜂的代謝穩(wěn)態(tài)和免疫功能，進(jìn)而降低蜜蜂的攝食量和生存率。

研究背景：

蜜蜂是農(nóng)業(yè)上以及世界上的自然生態(tài)系統(tǒng)最重要的傳粉者，對人類的糧食供應(yīng)做出了重大貢獻(xiàn)。作為采集昆蟲，當(dāng)它們采集花蜜和花粉時(shí)，蜜蜂特別容易受到外源毒素的暴露。在已知對蜜蜂有毒的農(nóng)用化學(xué)品中，新煙堿類殺蟲劑是世界范圍內(nèi)發(fā)展最快的殺蟲劑之一。研究表明，新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂和其它傳粉者有一系列的負(fù)面影響，包括對工蜂的行為、學(xué)習(xí)、記憶、免疫能力、定向和覓食等方面的影響，還會(huì)降低了蜂王的生殖力。烯啶蟲胺是應(yīng)用最廣泛的第二代新煙堿類殺蟲劑之一，與其他新煙堿類物質(zhì)一樣，烯啶蟲胺也是昆蟲煙堿乙酰膽堿受體（nAChR）的激動(dòng)劑，在昆蟲中樞神經(jīng)系統(tǒng)（CNS）的快速興奮性突觸傳遞中起重要作用。然而，由于其廣泛的用途和高水溶性的性質(zhì)，它可以很容易地轉(zhuǎn)移到環(huán)境中。先前的一項(xiàng)研究證明，在加拿大薩斯喀徹溫省薩斯卡通市30公里范圍內(nèi)的蜂箱中發(fā)現(xiàn)的花粉中含有烯啶蟲胺。同樣，最近的一項(xiàng)研究報(bào)告稱，在從中國不同地區(qū)采集的30份蜂蜜樣品中檢測到烯啶蟲胺殘留，其殘留量為13-41微克/千克。此外，據(jù)報(bào)道，烯啶蟲胺對非靶標(biāo)生物有不良影響，研究發(fā)現(xiàn)烯啶蟲胺對6種非靶標(biāo)生物有急性毒性，發(fā)現(xiàn)烯啶蟲胺對蚯蚓有中等毒性，對蜜蜂和家蠶有高毒性，因此應(yīng)重視烯啶蟲胺對環(huán)境生物的潛在危害及其毒性效應(yīng)。

腸道微生物在維持宿主健康方面發(fā)揮著重要作用。在蜜蜂體內(nèi)，腸道微生物群相對簡單和保守，具有食品加工、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和病原體防御等功能。因此，研究農(nóng)藥對腸道菌群的影響，將有助于探索農(nóng)藥的作用機(jī)理，有利于農(nóng)藥的使用和蜜蜂的保護(hù)。目前，新煙堿類殺蟲劑暴露對蜜蜂腸道菌群的負(fù)面影響的研究有限，只有最近的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)吡蟲啉降低了蜜蜂的存活率，但對腸道菌群沒有影響。因此，有必要對新煙堿類殺蟲劑進(jìn)行環(huán)境毒理學(xué)研究，以反映其對蜜蜂腸道微生物的環(huán)境風(fēng)險(xiǎn)。在本研究中，蜜蜂暴露在一系列濃度的烯啶蟲胺中14天，以評估存活率、食物消耗量和腸道細(xì)菌群落，以及探索對蜜蜂腸道基因譜的影響?？偟膩碚f，結(jié)果表明，暴露于烯啶蟲胺會(huì)擾亂蜜蜂的腸道微生物群，進(jìn)一步影響代謝穩(wěn)態(tài)和免疫，相信該結(jié)果可為新煙堿類殺蟲劑對蜜蜂的毒理學(xué)研究提供一些新的信息。

研究方法：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

蜜蜂連續(xù)喂飼含有3, 30, 300μg/L烯啶蟲胺濃度的50%（W/V）蔗糖溶液14天，50%蔗糖溶液作為對照（0微克/升）。每種處理組都有三個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)包括30只工蜂。每24小時(shí)更新處理液，記錄各組死蜂，計(jì)算存活率。每天在將注射器中的溶液放入容器之前和從容器中取出之后對其進(jìn)行稱重，這一差額相當(dāng)于前一天活蜜蜂所消耗的食物總量，計(jì)算每只蜜蜂所消耗的食物量。殺蟲劑處理后，工蜂的中腸被收集在1.5毫升離心管中，立即冷凍在液氮中，保存在-80度低溫冰箱，直到進(jìn)一步分析。

16S擴(kuò)增子相對定量測序：

從每個(gè)組中，6條中腸匯集成1個(gè)生物樣本，每組包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本（每組n=3），然后進(jìn)行16S擴(kuò)增子相對定量測序（V3-V4區(qū)域）。

RNA-seq測序：

從每個(gè)組中，6條中腸匯集成1個(gè)生物樣本，每組包括3個(gè)生物學(xué)重復(fù)樣本（每組n=3），然后進(jìn)行RNA-seq測序。

研究結(jié)果：

烯啶蟲胺對蜜蜂的急慢性毒性

在急性毒性試驗(yàn)中，蜜蜂在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)（24和48 hpf）的死亡率如圖1A所示。結(jié)果表明，烯啶蟲胺對蜜蜂的致死作用呈濃度依賴性。當(dāng)烯啶蟲胺濃度為3.00 毫克/升及以下時(shí)，對照組與烯啶蟲胺組24小時(shí)死亡率無顯著性差異，而濃度為3.00 毫克/升以上時(shí)死亡率有顯著性差異，當(dāng)暴露在6.00 毫克/升的烯啶蟲胺中，幾乎所有的蜜蜂都在48 hpf死亡（圖1A）。在慢性毒性試驗(yàn)中，對照組蜜蜂存活率在90%以上，3微克/升和30微克/升濃度組的蜜蜂存活率與對照組無顯著差異（圖1B）。而300微克/升烯啶蟲胺處理組12天和14天的蜜蜂存活率顯著低于對照組，分別低至76.6%和73.3%（圖1B）。暴露于烯啶蟲胺14d后，對蜜蜂的累積攝食量也有明顯的影響，如圖1C所示，與對照組相比，在濃度為3和30微克/升烯啶蟲胺時(shí)，累積食物消耗量沒有顯著差異。（圖1C），而暴露于300微克/升烯啶蟲胺的蜜蜂的累積食物消耗量顯著低于對照組蜜蜂（圖1C）。

圖1   300μg/L烯啶蟲胺對蜜蜂的毒性效應(yīng)。（A） 在24小時(shí)和48小時(shí)暴露于烯啶蟲胺后成年蜜蜂的急性死亡率。（B）不同濃度烯啶蟲胺對蜜蜂存活的影響。（C）不同濃度烯啶蟲胺對蜜蜂累積攝食量的影響。

烯啶蟲胺對蜜蜂腸道細(xì)菌群落的影響

為探討烯啶蟲胺對腸道菌群變化的影響，對對照組和暴露于300微克/升烯啶蟲胺14天的蜜蜂的腸道菌群進(jìn)行了分析（n=3）。通過基于V3-V4區(qū)的16S擴(kuò)增子測序，其中，對照組和300微克/升烯啶蟲胺組共同享有68個(gè)OTUs， 8個(gè)OTUs是在對照組特異存在，34個(gè)OTUs是在300微克/升烯啶蟲胺組特異存在。如圖2A所示，在門水平上，對照組和300微克/升烯啶蟲胺組中，Proteobacteria, Firmicutes 和Actinobacteria是最豐富的菌，兩組的微生物組成無顯著差異（圖2A）。在綱水平上，Gammaproteobacteria豐度顯著降低，從對照組的40.34%降低到300微克/升烯啶蟲胺組的11.09%（圖2B），烯啶蟲胺暴露后，Betaproteobacteria, Bacilli, Alphaproteobacteria的組成增加，Betaproteobacteria從26.10%增加到43.05%，Bacilli從27.10%增加到31.77%，Alphaproteobacteria從6.20%增加到13.17%（圖2B）。在屬水平， 300微克/升烯啶蟲胺組Frischella, Bartonella, Bifidobacterium的豐度均顯著增加，而Gilliamella的豐度顯著減少（圖2C）。

根據(jù)加權(quán)UniFrac的PCoA分析，300微克/升烯啶蟲胺組的腸道菌群與對照組有偏差（圖2D），但ADONIS分析得出PCoA的P值為0.20，表明兩組腸道菌群的差異不顯著。Top3菌屬的聚類分析結(jié)果顯示，烯啶蟲胺組腸道菌群與對照組相比差異顯著（圖2E）。此外，LEFSe分析表明，對照組中含有豐富的Gammaproteobacteria (class), Orbales (order), Orbaceae (family), Gilliamella (genera) and Gilliamella apicola (species)，而在300微克/升烯啶蟲胺組中，F(xiàn)rischella (genera) , Frischella perrara, Lactobacillus helsingborgensis (species)含量豐富（圖2F）。

圖2 烯啶蟲胺對蜜蜂腸道菌群組成的影響。（A） 對照組和300mg/L烯啶蟲胺組腸道菌群的門水平組成。（B）對照組和300mg/L烯啶蟲胺組腸道菌群的綱水平組成。（C） 對照組和300mg/L烯啶蟲胺處理組在屬水平注釋到的序列百分比。（D） UniFrac主成分分析法（PCoA）分析對照組和300300mg/L烯啶蟲胺處理組的腸道微生物群。（E）對照組和300mg/L烯啶蟲胺處理組前30個(gè)最豐富屬的聚類熱圖。（F） LEFSe分析顯示不同組別樣品中細(xì)菌的差異。

原始序列處理與基因定量表達(dá)

為研究烯啶蟲胺對蜜蜂腸道基因表達(dá)的影響，采用RNA-seq技術(shù)分析了烯啶蟲胺（300μg/L）處理14d后與對照組（n=3）相比的蜜蜂腸道差異表達(dá)基因（DEGs）。每個(gè)文庫測到超過420萬個(gè)原始序列，超過92.83%的序列能成功地匹配到蜜蜂基因組的唯一或多個(gè)位置。如圖3A所示，烯啶蟲胺組和對照組表達(dá)的基因平均數(shù)分別為9481和9402；兩組中共表達(dá)9265個(gè)基因（圖3A）。暴露于300微克/升烯啶蟲胺的蜜蜂共檢測到526差異表達(dá)基因（DEGs），其中240（45.6%）被上調(diào)，54.4%被下調(diào)（圖3B）。根據(jù)表達(dá)模式的相似性，兩組之間所有顯著差異表達(dá)的基因（SDEGs）被繪制在熱圖中（圖3C），分層聚類將對照組蜜蜂的所有三個(gè)樣本聚集在一個(gè)集群內(nèi)，而300微克/升烯啶蟲胺處理的蜜蜂形成另一個(gè)集群。使用其它聚類方法，如主成分分析（PCA），也得到了類似的結(jié)果（圖3D）。

除了未分類的基因外，我們還分析了表達(dá)上調(diào)最顯著的20個(gè)基因和表達(dá)下調(diào)最顯著的20個(gè)基因。這些差異基因編碼調(diào)節(jié)多種生物過程的蛋白質(zhì)或酶。例如，在暴露于300微克/升烯啶蟲胺的蜜蜂腸道中，參與代謝的幾個(gè)基因發(fā)生了變化，如PEPCK（基因ID 412843）、FAXDC2（基因ID 727357）和載脂蛋白（基因ID 408961）等。此外，一些與免疫和病原體防御相關(guān)的基因也發(fā)生了顯著的改變，如Secapin（基因ID 406145）、TLR4（基因ID 724187）、endochitinase（基因ID 551600）等。此外，300微克/升烯啶蟲胺對蜜蜂腸道中幾種解毒相關(guān)基因的表達(dá)也有影響，如CYP6A14（基因ID 724946）、E4（基因ID 409801）和過氧化物酶（基因ID 100577249）。

圖3  烯啶蟲胺（300μg/L）處理14d后與對照組相比的蜜蜂腸道差異表達(dá)基因（DEGs）。（A）Venn圖表示烯啶蟲胺處理組和對照蜜蜂之間顯著差異表達(dá)基因（SDEGs）的數(shù)量。（B） 烯啶蟲胺（300μg/L）處理14d后的蜜蜂的差異表達(dá)基因的火山圖。紅點(diǎn)：烯啶蟲胺處理蜜蜂的上調(diào)基因；綠點(diǎn)：烯啶蟲胺處理蜜蜂的下調(diào)基因；藍(lán)點(diǎn)：無顯著差異。（C）兩組之間所有顯著差異表達(dá)的基因（SDEGs）的熱圖分析。（D） 烯啶蟲胺組與對照組差異表達(dá)基因的主成分分析（PCA）。

GO功能和KEGG通路分析

根據(jù)GO分析，462 個(gè)DEGs被分為三類：分子功能、細(xì)胞成分和生物過程，其中大多數(shù)差異基因歸類為分子功能，包括蛋白質(zhì)異二聚活性、轉(zhuǎn)運(yùn)體活性、蛋白質(zhì)二聚活性、血紅素結(jié)合和四吡咯結(jié)合。在KEGG數(shù)據(jù)庫中，有84個(gè)DEGs被識別并映射到68個(gè)通路。表1列出了9條最重要的富集通路，包括戊糖和葡萄糖醛酸相互轉(zhuǎn)化、藥物代謝、抗壞血酸和醛酸代謝、甘油磷脂代謝、淀粉和蔗糖代謝、鞘脂代謝、色氨酸代謝和卟啉、葉綠素代謝和視黃醇代謝（表1）。

表1  9條顯著富集通路。

Real-Time qPCR驗(yàn)證

為了驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)的結(jié)果，我們選擇了15個(gè)DEGs，其中7個(gè)來自最上調(diào)基因，8個(gè)來自最下調(diào)基因進(jìn)行qPCR驗(yàn)證，其中大多數(shù)基因參與免疫功能，如免疫、代謝、解毒和抗氧化反應(yīng)，這些反應(yīng)蜜蜂是響應(yīng)環(huán)境壓力而激活的。如圖4A和4B所示，與對照組相比，烯啶蟲胺處理的蜜蜂的所有基因表達(dá)水平都有顯著差異（圖4A和4B），并且qPCR結(jié)果與測序結(jié)果一致。

圖4 實(shí)時(shí)定量PCR驗(yàn)證RNA-Seq數(shù)據(jù)。（A）從最上調(diào)的基因中選擇7個(gè)用于qPCR驗(yàn)證。（B） 從最下調(diào)的基因中選擇8個(gè)用于qPCR驗(yàn)證