SSR研究進展 11月集錦（一）

發(fā)稿時間：2019-12-06來源：天昊生物

1、基于轉(zhuǎn)錄組測序的缺須盆唇魚微衛(wèi)星標記特征分析

作者：任芳，馬秀慧

作者單位：1. 貴州大學動物科學院 2. 貴州大學特種水產(chǎn)動物研究所 3. 高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室

出版日期：2019-11-4

缺須盆唇魚(Placocheilus cryptonemus)是云南省怒江流域特有的一種高原經(jīng)濟魚類，主要分布于怒江水系。通過在Illumina HiSeq 2500平臺上對缺須盆唇魚進行轉(zhuǎn)錄組測序（RNA-seq）分析，利用MicroSAtellite（MISA）微衛(wèi)星識別工具對1～6個堿基重復、堿基數(shù)在10 bp以上的微衛(wèi)星進行鑒定。結(jié)果表明，在缺須盆唇魚轉(zhuǎn)錄組中，共發(fā)現(xiàn)分布在36764條Unigene上的30500個SSR位點，包含序列的SSR數(shù)量為18078，發(fā)生頻率49.17%。獲得的單純SSR中，共有215種重復基元，其中單核苷酸重復基元類型數(shù)量最多，為88個，六堿基重復的SSR最少，其他的重復從二、三、四、五堿基開始，SSR的形成呈現(xiàn)遞減規(guī)律。SSR位點的重復次數(shù)主要發(fā)生在6～10次和11～15次重復之間，發(fā)生頻率分別為38.59%，36.02%。本研究第一次對缺須盆唇魚的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行測序鑒定，得到了數(shù)量較多的SSR標記，同時對得到的缺須盆唇魚SSR數(shù)據(jù)特點進行歸納總結(jié)，本研究不僅提供了一個有價值的轉(zhuǎn)錄組資源，而且建立了一套SSR標記，可以為缺須盆唇魚的基礎(chǔ)研究、應(yīng)用研究提供有效的分子標記。

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2、地方曬煙種質(zhì)資源遺傳多樣性分析與評價

作者：李輝，李德芳，向世鵬

作者單位：1. 湖南文理學院生命與環(huán)境科學學院 2. 中國農(nóng)業(yè)科學院麻類研究所 3. 湖南省煙草公司長沙市公司 4. 湖南農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院

出版日期：2019-11-6

為更好地收集、鑒定和保存地方曬煙品種,高效率地利用地方曬煙種質(zhì)資源進行煙草品種選育。以67份地方曬煙品種的DNA為模板,利用篩選獲得的25對SSR引物進行PCR擴增,采用二進制記錄SSR分析結(jié)果,利用NTSY 2.1進行聚類分析,利用POPGENE 32.0進行遺傳多樣性分析。結(jié)果如下：(1) 25對SSR引物共檢測到83個多態(tài)性位點,品種間的遺傳相似系數(shù)變異范圍為0.60～0.84。(2)遺傳相似系數(shù)為0.62時,可以將67份曬煙品種分成3個類群,第Ⅰ類包括49份曬煙品種,第Ⅱ類包括13份曬煙品種,第Ⅲ類包括5份曬煙品種。(3)在曬煙資源中觀測等位基因數(shù)的平均值、有效等位基因數(shù)的平均值、觀測雜合度的平均值、期望雜合度的平均值分別為3.44個、2.762個、0.168、0.597。平均Nei’s基因多樣性指數(shù)(H)為0.593,平均Shannon’s指數(shù)(I)為1.013。其中期望雜合度的平均值大于0.5。本研究對67份曬煙種質(zhì)資源之間的遺傳多樣性較高,曬煙品種間的親緣關(guān)系和品種的地理來源之間無明顯相關(guān)性。

3、鯽魚基因組DNA的擴增及在SSR分析中的驗證

作者：武祥偉，羅榮，榮華，王曉雯，鄧君明，孔令富，畢保良

作者單位：1. 云南農(nóng)業(yè)大學動物科學技術(shù)學院 2. 云南省高原漁業(yè)資源保護與可持續(xù)利用重點實驗室 3. 云南省臨滄市鎮(zhèn)康縣水產(chǎn)技術(shù)推廣站

出版日期：2019-11-8

本研究使用內(nèi)切酶酶切初孵仔魚的基因組DNA,酶切片段連接寡核苷酸接頭,根據(jù)酶切位點序列與接頭序列設(shè)計引物,采用PCR法擴增酶切片段,增加基因組DNA的數(shù)量。結(jié)果使用Taq I內(nèi)切酶酶切鯽魚基因組DNA,酶切片段連接寡核苷酸接頭后PCR擴增,獲得擴增產(chǎn)物集中于250～1 500 bp。以擴增的滇池高背鯽魚基因組DNA為模板,PCR擴增滇池高背鯽魚的微衛(wèi)星分子標記(SSR)位點,獲得預(yù)期的擴增片段,電泳圖譜與對照組(未擴增的基因組DNA為PCR模板)無差異。本研究優(yōu)化了鯽魚基因組DNA的擴增方法,并可用于SSR分析中,為魚類大規(guī)模遺傳分析提供了技術(shù)支撐。

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4、基于SSR標記的38份歐洲報春種質(zhì)資源遺傳多樣性分析

作者：周琳，楊柳燕，張永春，錢海忠，姜武

作者單位：1. 上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室 2. 上海源怡種苗股份有限公司

出版日期：2019-11-7

為加快歐洲報春育種進程，本研究以慶典、丹諾雅、丹諾雅XL、丹妮莎、普利羅曼以及上海源怡種苗股份有限公司自主育種的春暉系列共38個歐報春品種為材料，利用24對SSR引物通過毛細管電泳檢測法進行了歐洲報春遺傳多樣性和遺傳關(guān)系分析。供試的24對SSR引物中11對引物穩(wěn)定性和多態(tài)性較好，可用于遺傳多樣性和聚類分析。多態(tài)性信息指數(shù)為0.360 3～0.953 3，平均值為0.814 9。38個歐洲報春品種分別來源于6個不同品系，6個品系遺傳距離都維持在較高水平，其中丹妮莎和普利曼羅間的遺傳距離最小，上海源怡種苗股份有限公司自主育種的春暉系列與慶典的遺傳距離最大，且春暉系列與其余5個品系的遺傳距離均大于0.5。通過STRUCTURE分析發(fā)現(xiàn)6個群體中5個基因庫的存在，且不同品系、不同花色的品種在基因庫組成比例存在較大差異。本研究初步通過已有SSR標記開展歐洲報春遺傳多樣性分析，篩選出的標記可用于不同品系遺傳距離的分析，但在不同品種DNA指紋圖譜構(gòu)建中還存在一定欠缺。后續(xù)將通過多種途徑開展歐洲報春SSR標記的開發(fā)，以推進歐洲報春的育種進程以及新品種鑒定工作。

5、基于RNA-Seq技術(shù)的乒乓菊轉(zhuǎn)錄組分析

作者：周琳，蔡友銘，張永春，楊柳燕，姚建軍，薛建平，葉燕萍，席祖路，于忠正

作者單位：1. 上海市農(nóng)業(yè)科學院林木果樹研究所上海市設(shè)施園藝技術(shù)重點實驗室 2. 上海虹華園藝有限公司

出版日期：2019-11-7

為開展乒乓菊基因功能分析、表型差異研究、分子標記開發(fā)和遺傳多樣性等研究，本試驗以‘綠乒乓’和‘粉乒乓’的花朵和葉片混合樣品為試驗材料，通過轉(zhuǎn)錄組測序分析，經(jīng)de novo組裝后獲得133200條unigenes，進一步利用六大公共數(shù)據(jù)庫對其進行注釋，共注釋64601條unigenes；并基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)開展SSR和SNP位點預(yù)測。結(jié)果表明：有25 462條unigenes參與了KEGG代謝通路，包括與花色、花期和藥用成分代謝等相關(guān)的途徑；共預(yù)測到1 444個轉(zhuǎn)錄因子，分屬于35個家族，包括在植物的生長發(fā)育、生物合成、抗非生物和生物脅迫等方面發(fā)揮重要作用的AP2/ERF、C2C2、bHLH、WRKY等轉(zhuǎn)錄因子家族，以及LBD、MADS和TCP等與花色素苷代謝、花和根系發(fā)育、植物進化和發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子家族。此外，從13014條unigenes序列中搜索到14905個SSR位點；并分別從‘綠乒乓’和‘粉乒乓’中挖掘到1081925和1077818個SNP位點。本研究可為乒乓菊功能基因挖掘和分子標記開發(fā)提供基礎(chǔ)。

6、木本油料植物光皮樹葉片轉(zhuǎn)錄組測序與分析

作者：周宵，彭映輝，陳景震，蔣麗娟，李昌珠，姚茂華，向祖恒，張良波

作者單位：1. 中南林業(yè)科技大學生命科學與技術(shù)學院 2. 湖南省林業(yè)科學院生物能源研究所 3. 湖南省龍山縣林業(yè)局 4. 北京林業(yè)大學生物科學與技術(shù)學院

出版日期：2019-11-7

用Illmina HiSeq測序平臺技術(shù)，對光皮樹葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序分析，經(jīng)組裝獲得36 839條unigene，與NR、String、Swissprot、KEGG等數(shù)據(jù)庫進行比對注釋，25 857條unigene得到注釋，注釋率為70.09%。光皮樹葉片轉(zhuǎn)錄組unigene在Pfam、NR、String、Swissprot、KEGG、KOG、GO等數(shù)據(jù)庫中被注釋的基因數(shù)目分別為14 776、25 758、13 761、16 900、10 575、9 656、15 286。注釋結(jié)果顯示，光皮樹與葡萄同源的序列最多，GO和KOG將其分成3大類別58個小組和3個功能類別；根據(jù)KEGG，13 114條unigene參與了33類代謝途徑。采用軟件MISA對unigene進行SSR檢測，36 839條中有8 945條有SSR，共搜索到10 828個SSR位點，SSR長度范圍在10～329 bp，平均長度為22.69 bp。SSR豐富度最高為二核苷酸，占所有SSR的58.07%，其次為一核苷酸和三核苷酸，分別占總SSR的27.02%和13.36%。本研究，通過光皮樹葉片轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了大量基因序列，了解了光皮樹基因的大致表達情況，同時為今后開發(fā)和利用光皮樹、分子生物學標記、光皮樹基因組的測序與組裝提供了數(shù)據(jù)參考，也為后續(xù)光皮樹在分子生物學研究、光皮樹核心種質(zhì)構(gòu)建以及定向育種等領(lǐng)域提供了依據(jù)。

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7、基于全長轉(zhuǎn)錄組測序的金烏賊微衛(wèi)星位點篩選與特征分析

作者：張金勇，何暮春，項子龍，柳淑芳，莊志猛

作者單位：1. 中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所農(nóng)業(yè)農(nóng)村部海洋漁業(yè)可持續(xù)發(fā)展重點實驗室 2. 青島海洋科學與技術(shù)試點國家實驗室海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室 3. 南京農(nóng)業(yè)大學無錫漁業(yè)學院 4. 中國海洋大學海洋生命學院 5. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院

出版日期：2019-11-7

本研究在金烏賊Pacific Biosciences 單分子實時(Single-molecule real-time, SMRT)測序技術(shù)和Illumina RNA-Seq 技術(shù)轉(zhuǎn)錄組測序獲得生物學數(shù)據(jù)信息的基礎(chǔ)上，獲得的177,951條Unigene，采用Micro Satellite (MISA)軟件檢測及分析其中的簡單重復序列(Simple sequence repeat, SSR)位點信息。結(jié)果顯示，在金烏賊轉(zhuǎn)錄組中共檢測出161,327個SSR位點，分布在64,933條Unigene中，SSR位點發(fā)生頻率為36.49%，出現(xiàn)頻率為90.66%。其中，最主要的重復類型為單核苷酸、二核苷酸和三核苷酸，分別占SSR總數(shù)的46.00%、39.93%和9.48%。SSR所包含的重復基元中，A/T是單核苷酸的優(yōu)勢重復基元，AT/AT和AC/GT是二核苷酸的優(yōu)勢重復基元類型。有66,004個重復基元長度≥20 bp，占SSR總數(shù)的40.91%，且其中含有低級重復基元(二、三核苷酸重復)SSR位點數(shù)量占優(yōu)。以上結(jié)果表明，金烏賊轉(zhuǎn)錄組中SSR位點出現(xiàn)頻率較高且類型豐富、多態(tài)性潛能較高，研究結(jié)果可為更好地開發(fā)金烏賊SSR分子標記、種質(zhì)資源保護利用、遺傳多樣性評價和分子標記輔助育種等提供參考。

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8、西洋接骨木轉(zhuǎn)錄組SSR挖掘及熒光標記開發(fā)

作者：姚俊修，李善文，任飛，李慶華，劉學良，吳德軍，燕麗萍

作者單位：1. 山東省林業(yè)科學研究院 2. 山東省林木遺傳改良重點實驗室 3. 山東農(nóng)業(yè)大學

出版日期：2019-11-11

轉(zhuǎn)錄組SSR引物的開發(fā)為接骨木遺傳多樣性分析、遺傳圖譜構(gòu)建和功能基因的挖掘提供豐富的遺傳標記。以一株成年西洋接骨木的果實為實驗材料，提取RNA后，采用Illumina HiSeq 2000高通量測序獲得西洋接骨木轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),共得到西洋接骨木轉(zhuǎn)錄組的257 975條Unigene，檢測到64 148個SSR位點，分布于51 336條Unigene,SSR位點出現(xiàn)頻率為24.87%(SSR位點數(shù)與總的Unigene數(shù)的比值)，其中，單核苷酸重復是主要類型，占總SSR的51.13%。其次是二、三核苷酸重復，分別占總SSR的38.63%和9.11%。A/T和AG/CT是單核酸和二核苷酸的優(yōu)勢重復基元。通過試驗優(yōu)化獲得最優(yōu)的兩步熒光引物PCR擴增體系。加M13接頭PCR擴增體系：10μL PCR體系中含DNA原液1μL,2×Mix 5μL,10μM引物各0.1μL，滅菌超純水3.8μL；熒光引物PCR擴增體系：20μL PCR體系中含第一步擴增產(chǎn)物DNA原液2μL,2×Mix 10μL,10μM M13接頭及反向引物各0.15μL，滅菌超純水7.7μL。利用已篩選的100對熒光SSR引物對8個不同種接骨木個體進行SSR擴增，80對可擴增出條帶，有效擴增率為80%,25對可成功擴增出多態(tài)性，多態(tài)性比率為31.25%，從25對具有多態(tài)性引物中選擇14對多態(tài)性較好的引物對不同種接骨木進行遺傳多樣性分析，14對多態(tài)性引物共檢測出67個等位基因(Na)，每位點3～7個，平均等位基因4.786個；每位點有效等位基因數(shù)(Ne)1.684～6.095個，平均有效等位基因數(shù)3.413個，觀測雜合度(Ho)及期望雜合度(He)分別在0～0.875和0.406～0.836之間，平均值分別為0.313、0.664;Shannon多樣性指數(shù)(I)在0.736～1.862之間，平均1.310。不同種接骨木具有較高的遺傳多樣性，25對具有多態(tài)性熒光SSR標記開發(fā)可為接骨木分子標記輔助育種、雜種優(yōu)勢預(yù)測等提供理論基礎(chǔ)。

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9、利用EST-SSR標記評價羽扇豆屬(Lupinus L.)遺傳多樣性

作者：張紅巖，楊濤，劉榮，晉芳，張力科，于海天，胡錦國，楊峰，王棟，何玉華，宗緒曉

作者單位：1. 中國農(nóng)業(yè)科學院作物科學研究所/國家農(nóng)作物基因資源與基因改良重大科學工程 2. 青海大學 3. 全國農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心 4.云南省農(nóng)業(yè)科學院糧食作物研究所 5. USDA-ARS Western Regional Plant Introduction Station (WRPIS)

出版日期：2019-11-11

利用基于窄葉羽扇豆轉(zhuǎn)錄組開發(fā)并篩選出的95對多態(tài)性EST-SSR標記，對羽扇豆屬的22個種133份資源進行全基因組掃描，初步探究羽扇豆屬下種間的進化關(guān)系，分析來源于舊世界羽扇豆種間的遺傳多樣性，為羽扇豆優(yōu)異資源的挖掘和創(chuàng)新利用提供理論依據(jù)。結(jié)果表明，用95對SSR標記共檢測出1318個等位變異，每對標記平均檢測出3～37個等位變異，平均為13.87個；多態(tài)性信息量(PIC)變化范圍0.39～0.91，平均為0.75；基因多樣性變化范圍0.41～0.92，平均為0.78?；卩徑臃?NJ)的系統(tǒng)發(fā)育初步探究了羽扇豆種間的進化關(guān)系，22個羽扇豆種分別來源于舊世界和新世界，與之前研究結(jié)果相對一致。聚類分析、群體結(jié)構(gòu)分析和主成分分析結(jié)果均表明，來源于舊世界的7個羽扇豆種被劃分為4個組群，各組群所包含的參試資源沒有種間交叉重疊。

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10、花椒cpSSR標記開發(fā)及在種間、種內(nèi)的通用性分析

作者：李思巧，韋伊，劉洪妤，張志東，張野，王麗華，劉玉林

作者單位：1. 西北農(nóng)林科技大學林學院 2. 四川省林業(yè)科學研究院生物技術(shù)與良種研究所

出版日期：2019-11-12

葉綠體基因組為母系遺傳，保守性高,因此葉綠體基因組中的簡單序列重復(SSR)標記可在更高分類水平上進行種質(zhì)資源鑒定和群體遺傳結(jié)構(gòu)分析。利用TRF軟件和SSR Hunter軟件相結(jié)合對花椒Zanthoxylum bungeanum葉綠體基因組中的SSR位點進行篩選。結(jié)果顯示：花椒葉綠體基因組中共有144個SSR位點,位點間的平均分布距離為1 100.00 bp?；跈z測軟件設(shè)置參數(shù),SSR重復類型主要集中在一、三核苷酸重復,二者占SSR位點總數(shù)的91.67%。此外,隨機設(shè)計合成30對SSR引物對10份花椒種質(zhì)、 5份竹葉花椒Zanthoxylum armatum種質(zhì)和1份日本花椒Zanthoxylum piperitum種質(zhì)進行PCR擴增檢測,共篩選出10對多態(tài)性引物,其中單核苷酸重復位點的多態(tài)性高于多核苷酸重復位點。本研究開發(fā)的葉綠體SSR標記可有效區(qū)分花椒、竹葉花椒和日本花椒,但在花椒種內(nèi)并未檢測出多態(tài)性。表明花椒葉綠體基因組的SSR標記可用于花椒屬不同種間的遺傳多樣性分析。

關(guān)于天昊：

天昊生物可以提供SSR分子標記的一代毛細管電泳檢測，并且基于二代高通量測序技術(shù)開發(fā)出SSRseq^TM專利技術(shù), 可以根據(jù)客戶項目需求，提供不同數(shù)量樣本和位點的高性價比SSR檢測服務(wù)。

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