祝賀！天昊SNPscan?高通量SNP分型技術(shù)助力客戶(hù)綿羊產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)遺傳研究

發(fā)稿時(shí)間：2019-12-13來(lái)源：天昊生物

摘要：天昊客戶(hù)發(fā)表綿羊遺傳育種文章

由蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院樂(lè)祥鵬老師課題組與甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院、

青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院、甘肅省肉羊繁育生物技術(shù)工程實(shí)驗(yàn)室等單位共同合作的研究成果近期發(fā)表在動(dòng)物遺傳育種著名期刊《Animals》上，研究成果發(fā)現(xiàn)候選基因中有九個(gè)單核苷酸多態(tài)性與湖羊或小尾寒羊的窩產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)，可以作為有用的遺傳標(biāo)記來(lái)改善窩產(chǎn)仔數(shù)的選擇。在這項(xiàng)研究中使用了天昊生物SNPscan^?高通量SNP分型技術(shù)。在恭喜客戶(hù)發(fā)表文章同時(shí)，我們也跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Association of Polymorphisms in Candidate Genes with the Litter Size in Two Sheep Breeds

中文題目：兩個(gè)綿羊品種候選基因多態(tài)性與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系

期刊名：Animals

影響因子： 1.832

發(fā)表時(shí)間：2019-11-12

研究摘要：

湖羊和小尾寒羊是中國(guó)飼養(yǎng)最廣泛和最著名的母羊品種，以早熟、常年發(fā)情和高繁殖力(每胎1-6只羔羊)著稱(chēng)。因此，增加這兩個(gè)品種的產(chǎn)仔數(shù)對(duì)集約化養(yǎng)羊業(yè)至關(guān)重要。這項(xiàng)研究的目的是確定與綿羊產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的潛在遺傳標(biāo)記，這些標(biāo)記位于10個(gè)基因上。本研究采集了537只湖羊和420只一胎仔數(shù)小尾寒羊的血樣。湖羊和小尾寒羊的平均產(chǎn)仔數(shù)分別為2.21和1.93。用DNA混池測(cè)序法檢測(cè)了與卵泡發(fā)育和雌性生殖相關(guān)的10個(gè)基因中潛在的單核苷酸多態(tài)性。SNPscan^?用于單獨(dú)基因分型。本實(shí)驗(yàn)在10個(gè)候選基因中的九個(gè)(除了NOG)中78個(gè)可能的SNPs進(jìn)行了檢測(cè)，共成功地鑒定出50個(gè)SNPs。質(zhì)量控制后，湖羊42個(gè)SNPs和小尾寒羊44個(gè)SNPs最終用于進(jìn)一步分析。關(guān)聯(lián)分析顯示6個(gè)基因中有9個(gè)SNPs與湖羊或小尾寒羊的產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)。兩個(gè)位點(diǎn)(LIFR: g.35862868C>T 和 LIFR: g.35862947G>T)單倍型的組合分析表明，在小尾寒羊中H2H3 (CTTT)單倍型組合產(chǎn)仔數(shù)比其余單倍型組合更多，也比單獨(dú)突變的多?？傊狙芯勘砻鳎?個(gè)基因中的9個(gè)重要的SNPs可以作為綿羊標(biāo)記輔助選擇的有用遺傳標(biāo)記。

研究背景：

產(chǎn)仔數(shù)是最重要的經(jīng)濟(jì)特征之一，它對(duì)養(yǎng)羊業(yè)的盈利能力有顯著影響。如果確定了與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的特定遺傳標(biāo)記，那么標(biāo)記輔助選擇可以用來(lái)改進(jìn)產(chǎn)仔數(shù)的選擇。基因組選擇是有效的，但是在大樣本的情況下是非常昂貴的。在候選基因中發(fā)現(xiàn)與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的單核苷酸多態(tài)性(SNPs)是在預(yù)算有限的情況下改善產(chǎn)仔數(shù)的另一種方法。眾所周知，排卵率和胚胎存活與綿羊產(chǎn)仔數(shù)直接相關(guān)。因此，掃描這些具有已知生殖生理功能的基因中的SNPs是一種有效的方法。根據(jù)現(xiàn)有文獻(xiàn)，選擇動(dòng)物中具有已知生殖生理功能的10個(gè)基因(NGF、NTRK1、KIT、KITLG、LIF、LIFR、NCOA1、ADAMTS1、NPM1和NOG)作為綿羊產(chǎn)仔數(shù)的潛在候選基因(圖1)。

圖1、十個(gè)候選基因的生殖生理功能

在中國(guó)，2017年家養(yǎng)綿羊的數(shù)量為1.1635億只，綿羊肉占反芻動(dòng)物肉類(lèi)產(chǎn)量的14.38%。湖羊和小尾寒羊是兩大綿羊品種，在我國(guó)廣泛用于集約化養(yǎng)羊系統(tǒng)(舍飼)。湖羊和小尾寒羊的估計(jì)庫(kù)存分別約為400萬(wàn)和500萬(wàn)只。這兩個(gè)品種通常作為雌性親本與優(yōu)良公羊品種雜交來(lái)生產(chǎn)肉類(lèi)。

盡管這10個(gè)基因在影響生殖生物學(xué)過(guò)程中的作用有相對(duì)明確的特征，但是對(duì)這些用于綿羊產(chǎn)仔數(shù)遺傳選擇的候選基因的評(píng)估還沒(méi)有廣泛和系統(tǒng)地進(jìn)行，特別是在湖羊和小尾寒羊中。本研究假設(shè)上述10個(gè)候選基因中的潛在SNPs可能與湖羊和小尾寒羊的產(chǎn)仔數(shù)有關(guān)。因此，本研究的目的是掃描這10個(gè)基因中的SNPs，并研究湖羊(n = 537)和小尾寒羊(n = 420)的SNPs與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系。本研究的發(fā)現(xiàn)可能作為湖羊和小尾寒羊的有用遺傳標(biāo)記。                                                                                                                                                                                           材料和方法：

表型數(shù)據(jù)收集和DNA提取：

在本研究中，所有母羊(湖羊和小尾寒羊)在相同的管理?xiàng)l件下飼養(yǎng)，并于2014年9月至12月交配，2015年2月至4月，采集了957只母羊血樣并記錄已產(chǎn)仔數(shù)，其中湖羊537只，小尾寒羊420只。本實(shí)驗(yàn)流程如圖2所示，湖羊和小尾寒羊產(chǎn)仔數(shù)記錄表型數(shù)據(jù)如圖3所示。湖羊的產(chǎn)仔數(shù)從1到5只不等，小尾寒羊從1到4只不等。湖羊和小尾寒羊的平均產(chǎn)仔數(shù)分別為2.21和1.93?；蚪MDNA用苯酚-氯仿法提取，然后溶解在雙蒸水中，在-20℃儲(chǔ)存。

圖2、實(shí)驗(yàn)方案示意圖

圖3、湖羊和小尾寒羊產(chǎn)仔數(shù)的頻率分布

SNP檢測(cè)和基因分型

總共為兩個(gè)綿羊品種構(gòu)建了10個(gè)DNA池，每個(gè)DNA池由10只個(gè)體組成，以鑒定所分析的10個(gè)基因中的潛在SNPs。如表1所述，這些個(gè)體是在所有不同的產(chǎn)仔數(shù)之間隨機(jī)選擇?？偣苍O(shè)計(jì)了119對(duì)引物來(lái)擴(kuò)增每個(gè)基因的所有外顯子和側(cè)翼區(qū)域，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，通過(guò)對(duì)序列進(jìn)行比較來(lái)檢測(cè)可能的SNPs。所鑒定的SNPs通過(guò)天昊生物SNPscan^?高通量SNP分型技術(shù)分別進(jìn)行基因分型，該方法基于連接酶連接和多重?zé)晒釶CR反應(yīng)進(jìn)行。從957個(gè)樣品中隨機(jī)選擇三個(gè)DNA樣品進(jìn)行兩次基因型鑒定，兩個(gè)空白樣品(ddH2O)用于消除交叉污染。

表1、每個(gè)DNA池中的樣本構(gòu)成在不同的產(chǎn)仔數(shù)之間維持平衡

群體參數(shù)計(jì)算與數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

利用SnpReady R包用于計(jì)算等位基因頻率、次要等位基因頻率(MAF)、多態(tài)信息含量(PIC)、預(yù)期雜合性(He)和觀(guān)察雜合性(Ho)，并進(jìn)行Hardy–Weinberg平衡檢驗(yàn)。如果MAF < 0.05和/或嚴(yán)重偏離哈迪-溫伯格平衡(p < 0.001)，則對(duì)這些SNPs進(jìn)行排除不再進(jìn)行進(jìn)一步分析。

SNP關(guān)聯(lián)分析

使用線(xiàn)性模型來(lái)對(duì)單個(gè)SNP和每個(gè)綿羊品種產(chǎn)仔數(shù)的影響進(jìn)行檢驗(yàn)：L = 1n m + G + e

，其中L是產(chǎn)仔數(shù)的n × 1向量(湖羊，n = 537小尾寒羊，n = 420)，1n是所有元素等于1的n × 1向量，μ是總體平均值，G是對(duì)應(yīng)于SNPs的固定效應(yīng)，e是隨機(jī)剩余效應(yīng)的n × 1向量?；蛐烷g平均產(chǎn)仔數(shù)的差異用R包中的LSD最小二乘法檢驗(yàn)。P < 0.05被認(rèn)為是顯著的。P < 0.01被認(rèn)為是非常顯著的。Bonferroni校正用于基因型組之間的多重測(cè)試。

單體型分析

在目前的研究中，只有每個(gè)綿羊品種同一基因中顯著關(guān)聯(lián)的SNPs被用來(lái)估計(jì)連鎖不平衡和單體型區(qū)塊的程度。湖羊的兩個(gè)顯著的SNPs和小尾寒羊的四個(gè)顯著的SNPs滿(mǎn)足這一前提，并且使用Haploview 4.2軟件估計(jì)顯著SNPs對(duì)和單體型區(qū)塊之間的LD程度。

研究結(jié)果：

基因分型和數(shù)據(jù)質(zhì)量控制

通過(guò)DNA混池測(cè)序，在9個(gè)候選基因(除了NOG)中共鑒定出78個(gè)潛在的SNPs。

補(bǔ)充材料、10個(gè)候選基因中78個(gè)鑒定SNPs的信息（部分）

在評(píng)估引物后，78個(gè)單核苷酸多態(tài)性中的50個(gè)使用SNPs掃描方法進(jìn)行了基因分型。在兩個(gè)空白樣品中檢測(cè)到三對(duì)技術(shù)重復(fù)的基因型相關(guān)系數(shù)等于1且沒(méi)有基因型信號(hào)，表明SNPscan^?高通量SNP分型技術(shù)方法是可靠的。排除MAF < 0.05和/或嚴(yán)重偏離哈迪-溫伯格平衡(p < 0.001)的8個(gè)湖羊SNPs和6個(gè)小尾寒羊SNPs，最后總共42個(gè)湖羊SNPs和44個(gè)小尾寒羊SNPs被用于進(jìn)一步分析(表2)。

表2、湖羊(HUS)42個(gè)SNPs和小尾寒羊(STH)44個(gè)SNPs的群體遺傳參數(shù)表（部分）

注：MA：次要等位基因；MAF：次要等位基因頻率；PIC：多態(tài)信息內(nèi)容；He：預(yù)期雜合性；Ho：觀(guān)察雜合性；x²和p值表示哈迪-溫伯格平衡檢驗(yàn)的卡方值和p值；“-”表示信息不可用。

與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的SNPs

表3詳細(xì)說(shuō)明了檢測(cè)的SNPs和產(chǎn)仔數(shù)之間的顯著關(guān)聯(lián)性。單個(gè)SNP關(guān)聯(lián)分析表明，湖羊的3個(gè)SNPs及小尾寒羊的4個(gè)SNPs是與產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)的，另外小尾寒羊中有2個(gè)SNPs是與產(chǎn)仔數(shù)為極顯著相關(guān)。其余36個(gè)SNPs與產(chǎn)仔數(shù)無(wú)顯著相關(guān)性。

表3、湖羊和小尾寒羊9個(gè)SNPs與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系（部分）

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9個(gè)重要的SNPs被映射到綿羊QTL數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.animalgenome.org/cgi-bin/QTLdb/OA/index)，以更好地理解這些SNPs的潛在作用。9個(gè)SNPs被定位到13個(gè)與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的數(shù)量性狀位點(diǎn)(表4)。SNPs和QTL之間的最近距離為1.8 Mb。

表4、湖羊和小尾寒羊與產(chǎn)仔數(shù)相關(guān)的9個(gè)顯著相關(guān)SNPs的數(shù)量性狀位點(diǎn)注釋

單體型分析

D′(r²)值是LD的一個(gè)指標(biāo)，在本研究中進(jìn)行了計(jì)算。D′(r²)分別為0.72 (0.34)和0.30 (0.04)，表明湖羊有2個(gè)SNPs (ADAMTS1: g.127753565T>C和ADAMTS1:g.127754640T>G) (圖4A)和小尾寒羊有2個(gè)SNPs (NCOA1: g.31928165C>T和NCOA1:g.32140565G>A)(圖4B)都并不緊密連鎖。而小尾寒羊中的2個(gè)SNPs (LIFR:g.35862868C>T和LIFR: g.35862947G>T))是緊密連鎖的(圖4C，D′和r²分別為0.97和0.84)。在小尾寒羊中鑒定出一個(gè)單倍型區(qū)塊(圖4C)，其中四個(gè)不同的單倍型是H1 (CG)、H2 (TT)、H3 (CT)和H4 (TG)。單體型頻率最高的是H1，占所有單體型的48.7%。H2是第二大比例，為47.1%，緊隨其后的是H3 (3.7%)和H4 (0.5%)(圖5)。由于低頻率的單倍型在統(tǒng)計(jì)分析中沒(méi)有意義，H4被排除在后續(xù)分析之外。關(guān)聯(lián)分析表明，單體型組合與小尾寒羊的產(chǎn)仔數(shù)顯著相關(guān)(表5)。H2H3 (CTTT)、H2H2 (TTTT)、H1H2(CTGT)個(gè)體的產(chǎn)仔數(shù)大于H1H1 (CCGG)個(gè)體。

圖4、ADAMTS1 (A)、NCOA1 (B)和LIFR (C)基因中顯著性SNPs的連鎖不平衡模式圖。紅色表示連鎖不平衡程度(D’值)

圖5、小尾寒羊兩個(gè)基因座（LIFR: g.35862868C>T和 LIFR:g.35862947G>T)的單倍型頻率

表5、小尾寒羊單體型組合與產(chǎn)仔數(shù)的關(guān)系表

結(jié)論：

本研究系統(tǒng)地研究了10個(gè)基因中潛在的SNPs作為綿羊產(chǎn)仔數(shù)增加的候選標(biāo)記。對(duì)6個(gè)基因中的9個(gè)SNPs (KIT:g.70199073A>G, KITLG: g.124520653G>C, ADAMTS1: g.127753565T>C, ADAMTS1: g.127754640G>T, NCOA1: g.31928165C>T, NCOA1: g.32140565G>A, LIFR: g.35862868C>T, LIFR: g.35862947G>T 和NGF: g.91795933T>C)和2個(gè)基因座單倍型分析表明，H2H3 (CTTT)組合單倍型在小尾寒羊中產(chǎn)仔數(shù)比其他組合單倍型多，這9個(gè)SNPs可作為小尾寒羊和湖羊群體遺傳標(biāo)記。

昊技術(shù)：

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