天昊微生物項(xiàng)目文章：【SBB】了解長期施加有機(jī)物料如何增加土壤磷酸酶活性：針對(duì)phoD和phoC功能性微生物種群的研究

發(fā)稿時(shí)間：2019-11-27來源：天昊生物

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)凌寧老師課題組近期在《Soil Biology and Biochemistry》上發(fā)表了長期施加有機(jī)物料如何增加土壤磷酸酶活性：針對(duì)phoD和phoC功能性微生物種群的研究文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了針對(duì)phoD和phoC功能性微生物種群的擴(kuò)增子測序工作。在恭喜客戶又發(fā)表高分文章的同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Understanding how long-term organic amendments increase soil phosphatase activities: Insight into phoD- and phoC-harboring functional microbial populations

中文題目：了解長期施加有機(jī)物料如何增加土壤磷酸酶活性：針對(duì)phoD和phoC功能性微生物種群的研究

期刊名：Soil Biology and Biochemistry 

影響因子： 5.29

研究概要：

在使用有機(jī)材料作為礦物肥料替代品的背景下，了解有機(jī)物料如何影響土壤細(xì)胞外磷酸酶活性是非常重要的，這是因?yàn)榱姿崦富钚阅芗铀儆袡C(jī)磷（P）的礦化。為了解決這一問題，本研究從微生物介導(dǎo)途徑的角度研究了有機(jī)物料對(duì)土壤酸性（ACP）和堿性（ALP）磷酸酶活性的影響，以及有機(jī)物料如何影響這些活性。本文對(duì)來自世界各地106項(xiàng)已發(fā)表研究的599項(xiàng)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行了meta分析，基于meta分析，有機(jī)物料與純礦物施肥相比，平均細(xì)胞外ACP和ALP活性分別提高了22%和53%，土壤有機(jī)碳（C）、全氮（N）和速效磷（P）含量以及微生物生物量C、N庫均顯著增加。根據(jù)我們一項(xiàng)30年的長期施肥田間試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)有機(jī)物料土壤中編碼ALP的phoD功能性微生物種群與編碼ACP的phoC功能性微生物種群關(guān)系更為密切，并且通過有機(jī)物料處理也確實(shí)觀察到更多的微生物網(wǎng)絡(luò)中心。土壤C:P和N:P比值以及微生物生物量C是phoC和phoD功能性微生物種群豐度、多樣性和群落組成的主要預(yù)測因子。我們的工作強(qiáng)調(diào)了理解土壤C:N:P化學(xué)計(jì)量法如何介導(dǎo)磷酸酶功能性微生物種群的重要性，以確定使用有機(jī)物料對(duì)增加磷酸酶活性的下游后果。

圖7 描述C:N:P化學(xué)計(jì)量學(xué)驅(qū)動(dòng)的phoD和phoC功能微生物對(duì)磷酸酶活性組合效應(yīng)的概念模式

研究背景：

雖然增加施入農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的磷（P）肥量暫時(shí)維持較高的作物吸收生物可利用磷水平，但在第一個(gè)作物種植季節(jié)，有效利用的礦物磷僅占施入總量的10-20%，由于金屬陽離子的沉淀、有機(jī)物池中的滯留或由于淋濾而損失，添加的大部分磷最終不可用。有機(jī)材料，如農(nóng)家肥、稻草或肥料和堆肥的混合物，已被提出作為礦物肥料的替代品。這些管理策略可以通過促進(jìn)植物的養(yǎng)分供應(yīng)，同時(shí)通過補(bǔ)充有機(jī)磷來維持土壤肥力，從而優(yōu)化未來磷資源的利用?；蛘撸寥牢⑸锟梢岳昧姿峄衔镒鳛樘荚?，通過胞外酶的產(chǎn)生和活性礦化有機(jī)磷。有機(jī)磷的礦化是由主要由土壤微生物群產(chǎn)生的土壤磷酸酶的胞外存在催化的，盡管植物也能分泌酸性磷酸酶。目前還沒有關(guān)于磷酸酶活性如何對(duì)有機(jī)物料作出反應(yīng)的共識(shí)，據(jù)報(bào)道，在不同程度上磷酸酶活性既減少又增加。酶的生產(chǎn)在能量和營養(yǎng)上都是昂貴的，需要微生物對(duì)C和營養(yǎng)物的投資（稱為細(xì)胞的經(jīng)濟(jì)政策）。由于物種營養(yǎng)需求和經(jīng)濟(jì)策略的固有差異，生物體通常對(duì)資源可用性作出非隨機(jī)響應(yīng)。當(dāng)?shù)匚⑸锓N群與環(huán)境的相互作用驅(qū)動(dòng)著土壤生態(tài)系統(tǒng)的關(guān)鍵過程，微生物將它們的資源分配給產(chǎn)磷酶，以實(shí)現(xiàn)最佳生長。土壤C:N:P化學(xué)計(jì)量是驅(qū)動(dòng)微生物群落組成的一個(gè)重要因素，可以限制生物地球化學(xué)循環(huán)，因此了解土壤C:N:P化學(xué)計(jì)量學(xué)是如何影響磷酸酶產(chǎn)生菌群和最終磷酸酶活性是至關(guān)重要的。在這里，我們對(duì)來自世界各地106個(gè)已發(fā)表研究的599個(gè)測量數(shù)據(jù)進(jìn)行了meta分析，以比較有機(jī)物料和礦物肥料對(duì)細(xì)胞外酸性磷酸酶（ACP）和堿性磷酸酶（ALP）活性和土壤C:N:P化學(xué)計(jì)量學(xué)的影響。ACP和ALP活性被用作評(píng)價(jià)有機(jī)磷礦化為生物可利用無機(jī)磷的指標(biāo)。我們假設(shè)有機(jī)物料將導(dǎo)致更高的活性，這將與土壤C:N:P化學(xué)計(jì)量的變化有關(guān)。以前的研究已經(jīng)調(diào)查了不同施肥制度下土壤中磷酸酶微生物種群。然而關(guān)于群落特征如何影響磷酸酶活性，其最終決定有機(jī)添加物對(duì)有機(jī)磷礦化的影響仍然是未知的。為了詳細(xì)說明meta分析的結(jié)果，并更好地了解有機(jī)物料對(duì)由ACP和ALP相關(guān)微生物種群介導(dǎo)的磷酸酶途徑的影響，我們在江西紅壤研究所進(jìn)行了一項(xiàng)30多年的田間試驗(yàn)，收集了四個(gè)施肥制度下的紅壤，選擇phoC和phoD基因分別作為ACP和ALP的生物標(biāo)記。我們進(jìn)一步假設(shè)，C:N:P化學(xué)計(jì)量驅(qū)動(dòng)的phoC和phoD功能性微生物種群有助于ACP和ALP活性的增加，用qPCR和擴(kuò)增子測序測定了上述兩種微生物種群的豐度、多樣性和組成。

研究方法：

研究地點(diǎn)和土壤取樣：

于1986年在中國江西紅壤研究所進(jìn)行長期施肥試驗(yàn)，該區(qū)屬典型的亞熱帶季風(fēng)氣候，年降水量為1537毫米，年蒸發(fā)量為1100～1200毫米，年平均氣溫為17.5℃。試驗(yàn)點(diǎn)自建立以來一直處于玉米-玉米輪作狀態(tài)。實(shí)施了以下四個(gè)處理：（1）對(duì)照，不施肥；（2）NPK，純礦肥；（3）M，純有機(jī)肥；（4）MNPK，化肥和有機(jī)肥配施。所有處理均在3個(gè)22 m 2（5.5 m~4 m）的田間復(fù)制區(qū)進(jìn)行。試驗(yàn)點(diǎn)自建立以來一直處于玉米-玉米-休耕輪作狀態(tài)。實(shí)施了以下四個(gè)處理：（1）對(duì)照，不施肥；（2）NPK，純礦物肥料；（3）M，純有機(jī)肥；（4）MNPK，化肥與有機(jī)肥聯(lián)合施用，每一個(gè)處理在不同的3個(gè)地塊有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)。2016年收獲后采集土壤樣本，簡單地說，從每個(gè)地塊收集了四個(gè)土芯（直徑5cm，深度0-20cm），混合后提供單一樣本，用篩子（<5mm）去除可見的植物物質(zhì)和有機(jī)碎屑。每個(gè)樣品的一部分儲(chǔ)存在4℃下，用于土壤理化性質(zhì)（有機(jī)碳SOC、總氮TN、有效磷AP）分析、磷酸酶活性（土壤細(xì)胞外酸性磷酸酶ACP和堿性磷酸酶ALP活性）和微生物生物量（微生物生物量C（MBC）和N（MBN））的測定，其余的儲(chǔ)存在-20℃提取DNA。

qPCR定量：

通過qPCR分析phoC和phoD功能性微生物種群中的phoD和phoC基因拷貝數(shù)。

phoC和phoD功能性微生物群落特征:

分別使用引物對(duì)ALPS-F730和phoC-A-F1/phoC-A-R1對(duì)phoD和phoC基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過高通量測序，評(píng)估含有phoD和phoC的微生物群落的多樣性和組成。

研究結(jié)果：

有機(jī)物料對(duì)磷酸酶活性的影響

根據(jù)對(duì)106項(xiàng)已發(fā)表研究中599項(xiàng)測量結(jié)果的meta分析，有機(jī)物料平均使土壤潛在ACP和ALP活性分別比純礦物施肥提高了22%和53%。有機(jī)物料處理土壤的微生物生物量（MBC，增加了54%；MBN，增加了31%）以及土壤有機(jī)C（29%）和養(yǎng)分含量（TN，19%；有效磷，48%）也比純礦物施肥（圖1A）高。所有這些變量和化學(xué)計(jì)量比都與ACP和ALP活性有很強(qiáng)的關(guān)系（圖1B）。

圖1  A：有機(jī)物料對(duì)土壤細(xì)胞外磷酸酶活性、微生物生物量庫和土壤C:N:P化學(xué)計(jì)量的平均影響大小；B：該網(wǎng)絡(luò)顯示磷酸酶活性與驅(qū)動(dòng)力（微生物生物量池和土壤C:N:P化學(xué)計(jì)量）之間的關(guān)系，虛線箭頭表示貢獻(xiàn)系數(shù)小于0.2，箭頭上方的數(shù)字表示樣本大小，箭頭的厚度表示關(guān)系的大小。

在田間施肥試驗(yàn)中，與NPK處理相比，有機(jī)物料處理（M和MNPK）的土壤潛在ACP和ALP活性分別提高345-569%和11-44%（圖2A和B）。有機(jī)物料處理土壤表現(xiàn)出與對(duì)照（對(duì)照組和NPK組）不同的土壤C、N和P含量及其比值、微生物生物量C和N及其比值。有機(jī)物料處理土壤有機(jī)碳、全氮含量、速效磷含量、微生物量碳、氮含量均高于對(duì)照組，支持了meta分析的結(jié)果。

有機(jī)物料對(duì)phoC和phoD功能性微生物種群的影響

phoD基因豐度的變化與土壤ALP活性的變化趨勢相似，M處理的豐度最高，MNPK次之（圖2C）。不同處理組間的phoC基因豐度沒有差異（圖2D）。然而，盡管phoD多樣性保持不變（圖2E-F），但不同處理組間phoC功能微生物的多樣性存在顯著差異。PCA分析表明phoD和phoC群落的組成有明顯的分離。

圖2  A-C：潛在堿性磷酸酶（ALP）活性，基因拷貝數(shù)估計(jì)的phoD基因豐度，Shannon指數(shù)估計(jì)的phoD微生物群落多樣性；D-F：潛在酸性磷酸酶（ACP）活性、基因拷貝數(shù)估計(jì)的phoC基因豐度和phoC微生物群落多樣性。

構(gòu)建了一個(gè)cladogram來說明phoC或phoD編碼基因的氨基酸序列與OTU豐度（平均相關(guān)豐度>0.05%）之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系（圖3）。具有高度相似性的氨基酸序列（ACP或ALP）可能由不同的phoD或phoC物種（OTUs）編碼，而任何一個(gè)OTUs也可能編碼不同的氨基酸序列（圖3）。phoD功能微生物的優(yōu)勢菌門是Actinobacteria（相對(duì)豐度為77-92%）、Planctomycetes（4-8%）和Firmicutes（2-6%），優(yōu)勢屬包括Streptomyces, Nocardiopsis, Micromonospora, Bacillus等（圖3A）。phoC功能微生物的優(yōu)勢菌門是Proteobacteria (58-88%), Bacteroidetes (3-19%) , Actinobacteria (1-7%)，其中優(yōu)勢菌屬有Altererythrobacter, Pricia, Desulfoluna, Bosea等（圖3B）。

圖3 A:Cladogram圖解了phoD氨基酸編碼序列與OTU豐度（平均相關(guān)豐度>0.05%）之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；B：Cladogram圖解了phoC氨基酸編碼序列與OTU豐度（平均相關(guān)豐度>0.05%）之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；分支的顏色代表了基于門水平序列的不同分類，OTU的顏色代表了基于屬水平序列的不同分類。在對(duì)照、NPK、M和NPK處理中，從內(nèi)到外的環(huán)代表了OTU的相對(duì)豐度。

phoD與phoC功能微生物群落的共生網(wǎng)絡(luò)

根據(jù)各處理間土壤理化性質(zhì)的變化，將處理分為有機(jī)（M和MNPK）和非有機(jī)物料處理（對(duì)照和NPK）兩組，并利用這兩組進(jìn)行指示物種和網(wǎng)絡(luò)分析，通過Dufrene-Legendre分析確定指示物種，以確定與特定處理相關(guān)的OTUs（圖4）。

圖4 通過Dufrene-Legendre分析確定的指示物種，用于鑒定與有機(jī)物料土壤（M和MNPK）和對(duì)照（對(duì)照和NPK）特別相關(guān)的OTUs。圓圈代表OTUs，每個(gè)圓圈的大小代表它的相對(duì)豐度。

利用網(wǎng)絡(luò)分析確定了phoD和phoC功能微生物群落的共生模式，無論采用什么處理，觀察到的正相關(guān)數(shù)目多于負(fù)相關(guān)數(shù)目（圖5）。與對(duì)照組相比，有機(jī)物料處理組中phoD微生物與phoC微生物聯(lián)系更緊密（例如節(jié)點(diǎn)和邊緣更豐富）（圖5）。有機(jī)物料處理組觀察到19個(gè)中心，其中OTU141（phoC，Xanthomonas）是一個(gè)邊緣數(shù)目比其它都多的關(guān)鍵分類單元。對(duì)照組中存在15個(gè)活躍的中心，OTU7（phoC，Xanthomonas）代表一個(gè)關(guān)鍵分類單元（圖5）。

圖5 phoD與phoC功能微生物群落的共生網(wǎng)絡(luò)。有機(jī)物料土壤（M和M NPK）與對(duì)照土壤（對(duì)照和NPK）之間存在強(qiáng)相關(guān)（Spearman'sρ>0.6）和顯著相關(guān)（p<0.05）。藍(lán)色邊緣表示兩個(gè)單獨(dú)節(jié)點(diǎn)之間的正交互，而紅色邊緣表示負(fù)交互。藍(lán)色節(jié)點(diǎn)表示屬于phoD基因的OTUs，紅色節(jié)點(diǎn)表示屬于phoC基因的OTUs。具有字的節(jié)點(diǎn)是網(wǎng)絡(luò)中的有效中心（前10個(gè)具有高連接性的OTU）。

細(xì)胞外磷酸酶活性的可靠預(yù)測因子

隨機(jī)森林模型一致認(rèn)為微生物生物量C在預(yù)測phoD功能微生物豐度中表現(xiàn)出更高的隨機(jī)森林MPI（26%），其次是土壤C:P比率（25%）（圖6A）。根據(jù)隨機(jī)森林分析，土壤C:P比率（26%）是主要的預(yù)測phoD功能微生物群落的因子，其次是土壤N:P比率（24%）和微生物生物量的C:N比率（23%）（圖6B）。通過進(jìn)一步確定ALP活性最可靠的預(yù)測因子，我們發(fā)現(xiàn)土壤C:P比顯示出最高的MPI（26%），其次是微生物生物量C（25%），以及phoD群落的豐度（24%）和組成（23%）（圖6C）。

與phoD基因相似，土壤C:P和N:P比值以及微生物生物量C也是phoC群落多樣性和組成的主要預(yù)測因子（圖6D和E）。通過進(jìn)一步確定ACP活性最可靠的預(yù)測因子，我們還發(fā)現(xiàn)土壤C:P比率表現(xiàn)出最高的MPI（25%），其次是phoC群落的多樣性（23%）和組成（23%），以及微生物生物量的C:N比率（23%）（圖6F）。

圖6 隨機(jī)森林分析確定磷酸酶（ALP和ACP）活性和phoD和phoC微生物豐度、多樣性和群落組成的主要預(yù)測因子。

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關(guān)于天昊

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