肺癌單細胞轉(zhuǎn)錄組文章匯總

發(fā)稿時間：2019-11-19來源：天昊生物

 

從本期開始小編將陸續(xù)對泛癌種單細胞轉(zhuǎn)錄組測序文章進行總結(jié)，展示每篇文章采用的研究方法、發(fā)現(xiàn)的主要結(jié)果以及提出的待解決的科學(xué)問題。某些癌種的單細胞轉(zhuǎn)錄組文章數(shù)量較多，目前僅討論那些以單細胞轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果為主線的文章（不考慮單細胞轉(zhuǎn)錄組方法類文章、單細胞轉(zhuǎn)錄組只占論文一小部分的文章以及單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)挖掘類文章）。

 

我國肺癌的發(fā)病率位居癌癥中首位，死亡率也是第一。以肺癌（lung cancer）為例，通過PubMed設(shè)置的多個關(guān)鍵詞檢索發(fā)現(xiàn)，截止到11月11日肺癌單細胞轉(zhuǎn)錄組文章共有6篇（單細胞轉(zhuǎn)錄組為主線內(nèi)容），每篇文章關(guān)注的細胞類型和研究目的各不相同。現(xiàn)將這6篇文章的主要內(nèi)容整理如下：

【一】

研究內(nèi)容及方法

2015年4月份東京大學(xué)團隊利用單細胞RNA測序分析了不同肺腺癌細胞系間的基因表達模式的差異，并且在靶向藥物處理條件下去研究每個細胞的轉(zhuǎn)錄組是如何變化的，親代細胞和耐藥細胞又有什么不同。研究人員利用Fluidigm C1系統(tǒng)一共分析了7種細胞系的336個單細胞RNA-seq文庫。
主要研究結(jié)果

首先在方法學(xué)上驗證了單細胞轉(zhuǎn)錄組測序?qū)τ趩蝹€細胞間的平均表達水平及相對基因表達差異的檢測是十分可靠的?；虮磉_的多樣性主要基于相應(yīng)的基因和通路。利用多酪氨酸激酶抑制劑vandetanib處理后的單細胞結(jié)果顯示，核糖體基因及其它所謂的看家基因的相對表達多樣性在藥物處理后會降低，然而vandetanib直接靶向的基因，如EGFR和RET則保持不變。對這些基因的嚴格轉(zhuǎn)錄控制可能不允許其表達隨藥物治療或耐藥性的獲得而發(fā)生可塑性變化。另外發(fā)現(xiàn)了癌癥相關(guān)基因的表達模式有時會比起始細胞中預(yù)期的更加多樣化。而且發(fā)現(xiàn)了這種多樣性在正常狀態(tài)下偶爾是潛在的，而在藥物處理后才開始變得明顯。基因表達差異的特征模式是無法利用傳統(tǒng)的一群細胞的轉(zhuǎn)錄組方法展示出來，其在細胞獲得耐藥中可能發(fā)揮了重要作用，亦可能是通過為基因表達程序提供細胞儲備。

觀點和潛在問題

1.這篇文章是在轉(zhuǎn)錄組層面上首次描述肺癌細胞的異質(zhì)性。2.文章所用到的細胞其細胞周期可能不一致，細胞微環(huán)境不能完全控制。3.無法評價在文庫構(gòu)建過程中系統(tǒng)偏差帶來的影響。4.無法將觀察到的差異的原因歸結(jié)為新獲得的基因突變或者表觀基因組的改變。5.有必要對更多類型的細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序以解釋表型的多樣性。

【二】

研究內(nèi)容及方法

2015年6月韓國團隊利用單細胞mRNA-seq發(fā)現(xiàn)了肺腺癌細胞在抗腫瘤藥物反應(yīng)中出現(xiàn)的亞克隆異質(zhì)性。研究人員從肺腺癌患者腫瘤移植模型（PDX）中分離了34個腫瘤細胞，利用Fluidigm C1系統(tǒng)進行單細胞mRNA-seq分析基因表達特征及表達的突變特征。文章同時也采用了普通的bulk細胞RNA-seq和全外顯子測序（WES）進行分析。

主要研究結(jié)果

發(fā)現(xiàn)了50個腫瘤特異的SNV，包括KRAS^G12D，其在單個PDX細胞中具有高度異質(zhì)性。利用半監(jiān)督聚類，基于KRAS^G12D突變的表達和69個肺腺癌預(yù)后基因表達代表的風(fēng)險評分（RS）可以將PDX細胞分成4組。體外抗腫瘤藥物處理后存活的PDX細胞顯示出與KRAS^G12D突變及低RS組一致的轉(zhuǎn)錄組特征。因此，通過對活的PDX細胞進行單細胞RNA-seq能夠發(fā)現(xiàn)與抗腫瘤耐藥相關(guān)的候選的腫瘤細胞，單細胞RNA-seq有助于揭示腫瘤特定細胞的表達特征，由此能夠促進臨床優(yōu)化抗癌策略的制定。

觀點和潛在問題

1.單細胞RNA-seq能夠提供基因表達和體細胞SNV的綜合信息，能夠?qū)⒓毎蛐?、表達特征和表型聯(lián)系起來。2.單細胞RNA-seq和bulk RNA-seq在表達和SNV數(shù)據(jù)上異同。3.新鮮分離的腫瘤細胞對于評估腫瘤異質(zhì)性可能比較重要。4.低RS的細胞反倒在藥物處理中存活下來，可能與藥物的作用靶點、耐藥真實影響的細胞范圍有關(guān)。

【三】

研究內(nèi)容及方法

2016年11月意大利團隊通過研究結(jié)直腸癌（CRC）和非小細胞肺癌（NSCLC）腫瘤組織中淋巴細胞轉(zhuǎn)錄組圖譜發(fā)現(xiàn)了腫瘤浸潤性調(diào)節(jié)T細胞的獨特性。研究人員將CRC或NSCLC中浸潤的Th1, Th17和Treg細胞的轉(zhuǎn)錄組與正常組織中的進行比較（普通RNA-seq），并且在單細胞水平上進行驗證。其中單細胞的實驗分別從5例CRC和5例NSCLC腫瘤樣本中分離CD4⁺ T細胞，以5名健康個體的PBMC樣本作為對照；純化Treg細胞，利用Fluidigm C1系統(tǒng)對總共858個Treg細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組分析（CRC: 320; NSCLC: 286; PBMC: 252）。

主要研究結(jié)果

發(fā)現(xiàn)了腫瘤浸潤的Treg細胞是高度被抑制的，上調(diào)了一些免疫檢查點及其配體轉(zhuǎn)錄本的表達，如IL1R2, PD-L1, PD-L2和CCR8趨化因子，而這些內(nèi)容之前在Treg細胞中未被發(fā)現(xiàn)。整個腫瘤組織樣本中Treg細胞特征基因（LAYN, MAGEH1, CCR8）的高表達與不良預(yù)后顯著相關(guān)。這些結(jié)果對腫瘤浸潤的Treg細胞的分子特征和功能的揭示提供新的視角，并且對腫瘤的免疫治療確定了潛在的靶點。
觀點和潛在問題

1.不同癌種來源的腫瘤浸潤Treg細胞可能共享一些基因表達特征，腫瘤微環(huán)境會影響Treg細胞的功能。2.有必要在不同的腫瘤浸潤免疫細胞中評估checkpoints和其配體的表達。3.單細胞的分析能夠很好地佐證全轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)，為基因表達數(shù)據(jù)提供更多信息。4.CCR8在腫瘤浸潤Treg細胞中高度特異性的表達表明其可能作為抑制Treg細胞的一個潛在靶點。

 

【四】

研究內(nèi)容及方法

2018年6月北大張澤民組和北大三院閆天生組利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序揭示了NSCLC中T細胞總體特征。利用Smart-Seq2方法對來源于14個未治療的NSCLC患者（11個腺癌，3個鱗癌）篩選的12,346個T細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，樣本包括腫瘤組織，癌旁組織和外周血。

主要研究結(jié)果

基于譜系示蹤聯(lián)合表達和T細胞抗原受體分析發(fā)現(xiàn)了一種組織內(nèi)的效應(yīng)T細胞具有很高比例，而且具有高度的遷移本性。和腫瘤浸潤的CD8⁺ T細胞會經(jīng)歷耗竭一樣，觀察到兩簇細胞也表現(xiàn)出耗竭前的狀態(tài)，而且一種高比例的“預(yù)耗竭”到耗竭狀態(tài)的T細胞與肺腺癌的良好預(yù)后相關(guān)。另外，在腫瘤調(diào)節(jié)性T細胞（Tregs）中觀察到的異質(zhì)性以TNFRSF9（抗原特異性Tregs的一種激活marker）的雙峰分布為特征。那些激活的腫瘤Tregs基因特征，包括IL1R2，與肺腺癌的不良預(yù)后相關(guān)。這項工作為患者的分層提供了新的方法，也為進一步理解肺癌中T細胞的功能狀態(tài)和動態(tài)變化提供了重要支撐。

觀點和潛在問題

1.激活的腫瘤Tregs細胞的臨床意義值得進一步研究。2.T細胞的組成對于NSCLC的分型可能是一項重要的biomarker。3.腫瘤浸潤性淋巴細胞的詳細分類對于當前的免疫治療藥物的區(qū)分選擇可能比較重要。4.單個免疫細胞表征的方法具有高維性和高的分辨率，同樣適用于其它癌種的研究。

【五】

研究內(nèi)容及方法

2018年7月比利時團隊利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)揭示了NSCLC腫瘤微環(huán)境（TME）中的基質(zhì)細胞表型特征。研究人員利用10x Genomics公司的Chromium系統(tǒng)對來源于5位患者的52,698個細胞進行單細胞轉(zhuǎn)錄組測序，分析其腫瘤微環(huán)境轉(zhuǎn)錄組特征，并且在3個額外樣本的40,250個細胞中進行驗證。

主要研究結(jié)果

通過與相應(yīng)的非惡性的肺組織比較，發(fā)現(xiàn)高度復(fù)雜的腫瘤微環(huán)境深刻塑造了基質(zhì)細胞。其中發(fā)現(xiàn)了52種基質(zhì)細胞亞型，包括迄今被認為是同種細胞類型的新的亞群，以及決定其異質(zhì)性的轉(zhuǎn)錄因子。例如，發(fā)現(xiàn)了成纖維細胞表達不同的膠原蛋白，內(nèi)皮細胞下調(diào)了免疫細胞歸巢以及一些與已確立的免疫檢查點轉(zhuǎn)錄本共調(diào)控的基因的表達，這些基因與T細胞活性相關(guān)。通過評估來自1,572名患者的bulk RNA-seq數(shù)據(jù)中這些細胞亞型的標記基因，闡明了這些marker基因如何與患者生存相關(guān)，而對選定的marker基因進行免疫組化驗證其在一系列獨立的肺腫瘤中是作為獨立的細胞實體。因此，這項研究通過表征基質(zhì)細胞的表型和同化方式（co-optive behavior）提供了一個全面的基質(zhì)細胞類型的目錄，這一資源為肺癌生物學(xué)提供了更深入的了解，并將有助于促進肺癌的診斷和治療。
觀點和潛在問題

1.亞型是代表不同的細胞類型，還是代表細胞在應(yīng)對TME刺激下所獲得的狀態(tài)仍不清楚，至少在一定程度上是語義問題。譜系示蹤（lineage tracing）是進一步闡明這一點的一個有吸引力的途徑。2.盡管在一些腫瘤中檢測到多種基質(zhì)細胞亞型，但這些基質(zhì)細胞表型是否也存在于影響其他器官的腫瘤中，以及它們是否在肺腫瘤轉(zhuǎn)移到其他器官時復(fù)發(fā)。3. 鱗狀細胞瘤的許多基質(zhì)細胞標記物與存活率呈負相關(guān)，與腫瘤分期無關(guān)。這種差異是否反映了基質(zhì)細胞對鱗狀癌細胞生物學(xué)的真正影響仍有待闡明。觀察到一些標記基因與不同隊列的生存密切相關(guān)，至少說明這些亞型特異性標記基因可以作為預(yù)后和治療反應(yīng)監(jiān)測的生物標志物。4. 腫瘤基質(zhì)中基因表達的改變?yōu)橹委煹脑O(shè)計提供了方向。

【六】

研究內(nèi)容及方法

2019年4月美國團隊利用單細胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)發(fā)現(xiàn)人和小鼠肺癌中的骨髓細胞群具有個體和物種間的保守性。研究人員利用inDrop的方法分析了7例人的肺癌組織樣本（5例腺癌，2例鱗癌），2例小鼠肺癌組織及2例健康小鼠對照樣本（小鼠樣本篩選了CD45⁺細胞），主要研究對象集中在免疫細胞亞群上。同時將患者腫瘤中的免疫細胞與血液中的做了對比。

主要研究結(jié)果

腫瘤浸潤性骨髓細胞（TIMs）主要由單核細胞、巨噬細胞、樹突細胞和中性粒細胞組成，其已成為癌癥生長的重要調(diào)控因素。這些細胞可以分化成一系列狀態(tài)，這些狀態(tài)可能促進或限制腫瘤的生長，但對其了解甚少。這篇文章利用單細胞轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對非小細胞肺癌患者的TIMs進行表征，發(fā)現(xiàn)了25中TIM狀態(tài)，其中大多數(shù)在患者中可以被重復(fù)發(fā)現(xiàn)。為了促進這些亞群的轉(zhuǎn)化研究，同時對小鼠的TIMs進行研究。對物種間的TIMs進行比較發(fā)現(xiàn)樹突細胞和單核細胞的群體結(jié)構(gòu)幾乎完全一致，中性粒細胞的子集也具有一定的保守性，而巨噬細胞則有一定的物種差異性。相比之下，患者血液中的髓細胞群結(jié)構(gòu)與TIMs中的重疊有限。這項研究確定了肺TIM的圖譜，為進一步研究TIMs作為免疫治療靶點的潛力奠定了基礎(chǔ)。

觀點和潛在問題

本項研究的三點局限性：1. 分析更多的患者可以發(fā)現(xiàn)更多的TIM亞型；2. 分析更多的細胞可以進一步細化TIM的異質(zhì)性；3.在與小鼠的比較中，僅僅使用了一個肺腺癌的模型，因此，當小鼠和人類之間出現(xiàn)差異時，就不知道這些差異是否由物種特異性差異造成。除此之外，這項研究還發(fā)現(xiàn)血液中的髓細胞很難反映TIM的狀態(tài)。

天昊生物

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