又一篇！天昊生物微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)再發(fā)好文

發(fā)稿時(shí)間：2019-10-23來源：天昊生物

濰坊醫(yī)學(xué)院楊潔教授課題組近期在《Carbohydrate Polymers》上發(fā)表了綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素的鏈構(gòu)象、理化性質(zhì)及其體外發(fā)酵的文章。在這項(xiàng)研究中使用了天昊生物創(chuàng)新型的的微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)。在恭喜客戶發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Chain conformation, physicochemical properties of fucosylated chondroitin

sulfate from sea cucumber Stichopus chloronotus and its in vitro fermentation by human gut microbiota

中文題目：綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素的鏈構(gòu)象、理化性質(zhì)及其體外發(fā)酵

期刊名：Carbohydrate Polymers 

影響因子： 6.044

研究概要

本文采用HPSEC-MALLS和worm-like cylinder模型方法研究了綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS-Sc)的鏈構(gòu)象和理化性質(zhì)，同時(shí)通過16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序研究它對(duì)人體腸道菌群的影響。結(jié)果表明綠刺參巖藻糖基硫酸軟骨素(fCS-Sc) 在PBS中采用剛性棒狀鏈構(gòu)象，鏈構(gòu)象參數(shù)分別為α_η（1.11）和α_h（0.70）。從worm-like cylinder模型推導(dǎo)出的剛度參數(shù)表明fCS-Sc表現(xiàn)為剛性鏈。剛果紅分析顯示為單螺旋結(jié)構(gòu)。fCS-Sc在較寬的ph范圍內(nèi)表現(xiàn)出負(fù)的zeta電位和良好的熱穩(wěn)定性。此外，fCS-Sc還可以通過提高腸道菌群的絕對(duì)豐度來調(diào)節(jié)腸道菌群的群落結(jié)構(gòu)，例如增加有益菌Megamonas、Bacteroides、Fusobacterium、Parabacteroides、Prevotella、Faecalibacterium，抑制病原微生物，從而促進(jìn)短鏈脂肪酸的產(chǎn)生。本研究進(jìn)一步加深了對(duì)fCS-Sc空間結(jié)構(gòu)的認(rèn)識(shí)，以及fCS-Sc作為益生元的應(yīng)用。

研究背景

巖藻糖基硫酸軟骨素（fCS）是從海參中提取的一種獨(dú)特的天然硫酸軟骨素類似物，含有硫酸巖藻糖支鏈。從不同海參中獲得的巖藻糖基硫酸軟骨素（fCS）結(jié)構(gòu)各不相同。不同種類海參的fCS具有相似的硫酸軟骨素骨架結(jié)構(gòu)和不同硫酸基取代的巖藻糖分支。巖藻糖基硫酸軟骨素（fCS）因其多種生物活性而受到廣泛關(guān)注，它具有明顯的抗凝、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移、抗病毒、改善高血糖等作用。

目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多糖的化學(xué)結(jié)構(gòu)如單糖組成、糖苷結(jié)構(gòu)、取代基、分子量和鏈構(gòu)象對(duì)其活性有明顯的影響。HPSEC-MALLS技術(shù)被廣泛應(yīng)用于多糖鏈構(gòu)象的測(cè)定。近年來人們利用SEC-MALLS方法對(duì)fCS的鏈構(gòu)象進(jìn)行了研究。從刺參Apostichopus japonicus中提取的fCS在0.15 M NaCl（ph 7.4）中具有隨機(jī)的線圈結(jié)構(gòu)。在0.2M的NaCl溶液中， Isostichopus badionotus和Pearsonothuria graeffei 的fCS具有隨機(jī)的螺旋構(gòu)象。然而，從綠刺參中分離得到的fCS的鏈構(gòu)象還沒有研究。

近年來，生物活性多糖的益生元功能受到了廣泛關(guān)注。腸道菌群作為一種功能器官，在人類健康與宿主飲食的相互作用中發(fā)揮著重要作用。同時(shí)，闡明益生元組分與腸道菌群之間的聯(lián)系有助于其作為功能性食品的應(yīng)用。由于人類消化系統(tǒng)不能產(chǎn)生足夠的碳水化合物水解酶，腸道微生物群在多糖代謝中發(fā)揮著重要作用。腸道微生物群降解多糖，產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs，如乙酸、丙酸和丁酸），在維持上皮屏障功能、調(diào)節(jié)上皮細(xì)胞增殖、調(diào)節(jié)免疫功能、預(yù)防結(jié)直腸癌等方面發(fā)揮重要作用。在我們之前的研究中，我們從綠刺參中獲得了一種巖藻糖基硫酸軟骨素（fCS-Sc），并對(duì)其化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征研究。為進(jìn)一步闡明其構(gòu)效關(guān)系，采用HPSEC-MALLS方法對(duì)鏈構(gòu)象進(jìn)行了測(cè)定，并worm-like cylinder模型方法進(jìn)行了進(jìn)一步的解釋，研究了zeta電位和熱穩(wěn)定性等物理化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)也是首次對(duì)fCS-Sc的體外發(fā)酵進(jìn)行了研究。

研究方法

fCS-Sc體外發(fā)酵：

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，對(duì)fCS-Sc進(jìn)行了體外發(fā)酵研究。將fCS-Sc或低聚果糖（FOS，陽性對(duì)照）溶于培養(yǎng)基中（10mg/ml），高壓滅菌。新鮮糞便樣本來自三名自愿捐贈(zèng)者（兩名女性和一名男性，年齡25-35歲），他們?cè)谌齻€(gè)月內(nèi)沒有胃腸道疾病或抗生素治療。將每個(gè)供者的相同量糞便樣本混合，用PBS稀釋成10%（w/v）的糞漿，以500rpm離心5min，除去食物殘?jiān)?。然后，?ml空白培養(yǎng)基（對(duì)照組）或含fCS-Sc或FOS的培養(yǎng)基與1ml糞漿混合。將混合物立即放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中，37℃孵育24小時(shí)。在Silgreen陽離子交換柱（300×7.8mm）上分析培養(yǎng)基中的SCFAs含量，用8mM H₂ SO₄洗脫，215nm檢測(cè)。

16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序：

使用FastDNA? SPIN Kit (MP Biomedicals, LLC, USA)提取樣本微生物基因組DNA，然后在上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序（V3-V4）。

研究結(jié)果

fCS-Sc的理化性質(zhì)

HPSEC-MALLS-Visc-RI結(jié)果表明，fCS-Sc在PBS中呈剛性棒狀鏈構(gòu)象。M_w、[η]、R_h和構(gòu)象參數(shù)α_η和α_h分別為63.2±0.6 kDa、64.1±0.3mL/g、9.62±0.03nm、1.11±0.01和0.70±0.01。根據(jù)類蠕蟲柱體模型計(jì)算了更多的構(gòu)象參數(shù)，結(jié)果表明，M_L，q，d， C_∞分別為793g/mol?nm、11.22±0.60nm、1.00nm和21.4，結(jié)果表明fCS-Sc具有一定的鏈剛度。剛果紅試驗(yàn)表明，fCS-Sc具有高度有序的單螺旋結(jié)構(gòu)。fCS-Sc在較寬的ph范圍內(nèi)呈現(xiàn)負(fù)zeta電位，熱穩(wěn)定性較好。

fCS-Sc對(duì)腸道菌群的影響

采用新鮮人糞便體外發(fā)酵和高通量測(cè)序分析，研究fCS-Sc對(duì)腸道菌群的影響。9個(gè)樣品（3組，每組3個(gè)重復(fù)）共獲得3099052條原始序列。在對(duì)原始序列進(jìn)行過濾并以97%的相似性進(jìn)行聚類后，每個(gè)樣本獲得254±19個(gè)OTUs。樣本稀疏曲線和shannon曲線都表明測(cè)序深度覆蓋了最大的多樣性。不同組別產(chǎn)生的OTUs的venn圖顯示，所有組別共有246個(gè)OTUs。如表1所示，與對(duì)照組相比，fCS-Sc組的群落豐富度指數(shù)chao1和ACE指數(shù)顯著高于對(duì)照組。fCS-Sc組的群落多樣性指數(shù)（shannon指數(shù)）也明顯高于對(duì)照組，這些結(jié)果表明fCS-Sc能促進(jìn)腸道微生物的豐富性和多樣性。

表1 不同組別的alpha多樣性

主坐標(biāo)分析（PCoA）結(jié)果表明，fCS-Sc處理后，三組菌群的微生物組成有明顯的聚集性，微生物結(jié)構(gòu)有明顯的變化（圖5a）。上述結(jié)論也得到了OTUs水平Bray-Curtis聚類分析結(jié)果的證實(shí)（圖5b）

圖5 基于主坐標(biāo)分析（a）、聚類分析（b）的微生物群落結(jié)構(gòu)差異研究

不同于以往對(duì)特定樣品中微生物相對(duì)豐度的研究，靶向微生物在不同樣品間的絕對(duì)豐度越來越受到關(guān)注。樣品中微生物群的絕對(duì)定量是通過添加spike-in序列及其生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線來實(shí)現(xiàn)的。各細(xì)菌類群在門水平上的相對(duì)豐度和絕對(duì)拷貝數(shù)如圖6a所示，結(jié)果表明，隨著fCS-Sc和FOS的處理，微生物組成發(fā)生了明顯變化。尤其是fCS-Sc處理組的微生物絕對(duì)豐度是對(duì)照組的2.74倍，說明fCS-Sc是一種有效的益生元，能顯著促進(jìn)腸道微生物的生長(zhǎng)。此外，F(xiàn)OS能促進(jìn)微生物群的生長(zhǎng)，比對(duì)照組增加1.33倍。在門的水平上，腸道微生物群主要由Proteobacteria、Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria、Fusobacteria組成（圖6a）。厚壁菌/類桿菌比例 (F/B) 與高熱量飲食引起的肥胖密切相關(guān)，從圖6a可以看出，與對(duì)照組相比，fCS-Sc和FOS顯著降低了F/B比值，分別從6.83降至1.55和3.12（p<0.05），說明fCS-Sc通過降低厚壁菌/類桿菌比值來有利宿主健康。結(jié)果還表明，fCS-Sc的發(fā)酵主要是由擬桿菌和梭桿菌引起的。在屬水平上（圖6b），腸道菌群主要由Escherichia/Shigella、Clostridium_XlVa、Megamonas、Dialister、Bacteroides、Fusobacterium、Bifidobacterium等組成，與對(duì)照組相比，fCS-Sc和FOS處理組的腸道菌群組成有明顯變化，說明fCS-Sc和FOS能顯著促進(jìn)某些不同種類腸道菌群的生長(zhǎng)。

圖6 主要細(xì)菌在門（a）和屬（b）水平上的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度

為了進(jìn)一步闡明不同組之間的細(xì)菌組成差異，三組的腸道微生物群的熱圖如圖7所示，人類腸道糞便中65種主要屬發(fā)現(xiàn)有顯著差異。將相對(duì)豐度低于1%的屬從類群中剔除后，選出17個(gè)屬進(jìn)行比較，與對(duì)照組相比，fCS-Sc顯著增加了Megamonas（1.26倍）、Bacteroides（5.18倍）、Fusobacterium（13.3倍）、Parabacteroides（6.11倍）、Prevotella（21.0倍）、Faecalibacterium（17.0倍）的豐度，降低了Clostridium_XlVa、Bifidobacterium、Dialister、Enterobacter、Phascolarctobacterium、Dorea的豐度。Megamonas可以產(chǎn)生醋酸鹽來促進(jìn)脂肪生成和膽固醇形成，它在FOS組中也有顯著的增加，如先前報(bào)道一樣。類桿菌是產(chǎn)生SCFAs的細(xì)菌，在維持微生物區(qū)系中起著重要的作用，可能與抗菌能力有關(guān)。Prevotella與難消化碳水化合物的水解有關(guān)，而且Prevotella增多可能會(huì)調(diào)節(jié)血糖，降低患糖尿病的風(fēng)險(xiǎn)。Bacteroides和Prevotella是兩種利用fCS-Sc的有益腸道菌群，而Clostridium_XlVa被認(rèn)為是條件致病菌，Dorea被認(rèn)為是促炎癥屬，這兩種菌在fCS-Sc組均明顯減少。這些研究結(jié)果表明，fCS-Sc通過增加有益菌的數(shù)量和抑制病原微生物對(duì)腸道菌群具有調(diào)節(jié)作用。

圖7 屬水平腸道微生物組成的熱圖

發(fā)酵過程中產(chǎn)生的SCFAs

SCFAs（短鏈脂肪酸）是腸道菌群對(duì)不溶性多糖的主要發(fā)酵產(chǎn)物，對(duì)維持大腸正常功能和結(jié)腸上皮細(xì)胞形態(tài)具有重要作用。不同組別發(fā)酵24小時(shí)后的SCFAs含量見表2，結(jié)果表明，樣品中的主要發(fā)酵產(chǎn)物為乙酸、丙酸和異丁酸。fCS-Sc能明顯促進(jìn)乙酸、丁酸和異戊酸的產(chǎn)生，另一方面，F(xiàn)OS處理使乙酸、丙酸含量顯著增加，異丁酸含量顯著降低。FOS組未檢測(cè)到丁酸和異戊酸。

表2 體外發(fā)酵過程中短鏈脂肪酸的產(chǎn)生

研究結(jié)論

HPSEC-MALLS-Visc-RI結(jié)果表明，fCS-Sc在PBS中呈剛性棒狀鏈構(gòu)象。M_w、[η]、R_h和構(gòu)象參數(shù)α_η和α_h分別為63.2±0.6 kDa、64.1±0.3mL/g、9.62±0.03nm、1.11±0.01和0.70±0.01。根據(jù)類蠕蟲柱體模型計(jì)算了更多的構(gòu)象參數(shù)，結(jié)果表明，M_L，q，d， C_∞分別為793g/mol?nm、11.22±0.60nm、1.00nm和21.4，結(jié)果表明fCS-Sc具有一定的鏈剛度。剛果紅試驗(yàn)表明，fCS-Sc具有高度有序的單螺旋結(jié)構(gòu)。fCS-Sc在較寬的ph范圍內(nèi)呈現(xiàn)負(fù)zeta電位，熱穩(wěn)定性較好。此外，fCS-Sc通過促進(jìn)腸道菌群的豐富性和多樣性，促進(jìn)有益細(xì)菌生長(zhǎng)和SCFAs（短鏈脂肪酸）的產(chǎn)生，對(duì)腸道菌群有顯著的調(diào)節(jié)作用。本研究有助于了解fCSs的鏈構(gòu)象及其在食品、醫(yī)藥等行業(yè)中的應(yīng)用。

常規(guī)擴(kuò)增子測(cè)序和qPCR技術(shù)痛點(diǎn)

     常規(guī)16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)雖然其具有高通量，低花費(fèi)，可客觀還原菌群結(jié)構(gòu)及相對(duì)豐度比例的巨大優(yōu)勢(shì)，但是其是通過某一OTU分類單元的序列數(shù)所占總序列數(shù)的比值來獲得某個(gè)細(xì)菌的相對(duì)豐度比例信息，然而相對(duì)豐度信息不能反映樣本中物種真實(shí)的絕對(duì)豐度情況，例如微生物某一類群的相對(duì)豐度比例增加不一定真正是相應(yīng)微生物類群的絕對(duì)豐度增加，可能是其它微生物類群的絕對(duì)豐度減少是導(dǎo)致其在群落結(jié)構(gòu)中相對(duì)豐度比例的增長(zhǎng)，因此常規(guī)16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)基于相對(duì)定量分析的錯(cuò)誤結(jié)果解釋可能導(dǎo)致假定的因果關(guān)系！

         qPCR絕對(duì)定量技術(shù)雖然可以進(jìn)行物種絕對(duì)定量分析，但是qPCR定量實(shí)驗(yàn)結(jié)果常常不穩(wěn)定，且特定物種qPCR需要設(shè)計(jì)特定引物，對(duì)引物特異性要求較高，且引物優(yōu)化難度較大，導(dǎo)致常規(guī)的qPCR絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)不再適用于組成較為復(fù)雜的環(huán)境樣本微生物絕對(duì)定量。此外，當(dāng)環(huán)境樣本中往往含有腐殖酸，這些腐殖酸會(huì)通過抑制酶的活性抑制PCR，從而影響qPCR對(duì)細(xì)菌拷貝數(shù)定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

天昊16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)簡(jiǎn)介

該技術(shù)是一種將qPCR絕對(duì)定量技術(shù)和常規(guī)16S擴(kuò)增子測(cè)序技術(shù)合二為一的技術(shù)，該技術(shù)不但可以進(jìn)行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析、指標(biāo)和微生物相關(guān)性分析等常規(guī)16S擴(kuò)增子測(cè)序分析，關(guān)鍵可以解析樣本中總細(xì)菌的絕對(duì)拷貝數(shù)，還可以解析樣本中每個(gè)物種的絕對(duì)拷貝數(shù)，因而對(duì)微生態(tài)學(xué)內(nèi)許多懸而未決的問題具有進(jìn)一步闡明的潛力。此外，該技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌拷貝數(shù)定量時(shí)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的內(nèi)標(biāo)和樣本DNA是在同一個(gè)樣本孔中一起進(jìn)行PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)效率相同，因此校正了腐殖酸對(duì)PCR的影響，避免了腐殖酸等PCR抑制物對(duì)樣品細(xì)菌16S拷貝數(shù)定量的影響，因此針對(duì)土壤、水體和淤泥等環(huán)境樣本，天昊生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)計(jì)算得到的細(xì)菌16S拷貝數(shù)相對(duì)于qPCR更準(zhǔn)確。

天昊16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)應(yīng)用情況

目前天昊微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)完成項(xiàng)目近百個(gè)，合作單位包括中國科學(xué)院微生物研究所、中國科學(xué)院南京土壤研究所、中國科學(xué)院水生生物研究所、同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院、廈門大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院、中國農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鹽城工學(xué)院、南京財(cái)經(jīng)大學(xué)、南京中醫(yī)藥大學(xué)、武漢大學(xué)中南醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院等多個(gè)單位，覆蓋環(huán)境土壤微生物，環(huán)境水體微生物和醫(yī)學(xué)腸道微生物等多個(gè)領(lǐng)域，利用該技術(shù)的項(xiàng)目文章成功發(fā)表在環(huán)境科學(xué)期刊《Science of the Total Environment》（IF= 5.589）和應(yīng)用化學(xué)1區(qū)期刊《Carbohydrate Polymers》（IF=6.044）上，目前該技術(shù)因其創(chuàng)新性、準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性受到客戶的廣泛好評(píng)！ 天昊生物目前是國內(nèi)唯一一家提供 “微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序”技術(shù)的服務(wù)商，熱烈歡迎各位老師與我們交流溝通！