6個樣本全轉錄組測序，輕松斬獲4.2分文章

發(fā)稿時間：2019-10-17來源：天昊生物

當你手中有好的實驗材料時，從全轉錄組（mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA）角度入手，不失為一種高效的研究策略。剛剛在上月發(fā)表的一篇文章，就利用該策略系統(tǒng)闡述了油菜細胞質(zhì)雄性不育系花藥發(fā)育中的circRNA表達模式及ceRNA和miRNA-mRNA間的調(diào)控網(wǎng)絡。

發(fā)表期刊：Int. J. Mol. Sci.  發(fā)表時間：2019-9-27  影響因子：4.183

植物的雄性不育，是指它們不能產(chǎn)生正常功能的花粉粒。細胞質(zhì)雄性不育是一種重要的植物繁殖特性，可作為開發(fā)作物雜種優(yōu)勢的有用工具。之前研究發(fā)現(xiàn)了一些mRNA和miRNAs可以作為細胞質(zhì)雄性不育系統(tǒng)的重要調(diào)節(jié)因子。環(huán)狀RNA(circRNA)是一類新型共價閉合的單鏈內(nèi)源性非編碼RNA，也可以通過競爭性內(nèi)源RNA(ceRNAs)調(diào)控機制，參與轉錄后調(diào)控過程。

在本文中，研究者在油菜上建立了細胞質(zhì)雄性不育系（sterile line）Bcpol97-05A和可育系（fertile line）Bcah97-01B，通過全轉錄組測序對不育系和可育系共6個樣本（2類樣本各3次重復）的花蕾進行了RNA表達譜比較，共鑒定出31個差異表達的circRNAs、47個差異表達的miRNAs和4779個差異表達的mRNAs (注：本文未提到lncRNA相關信息，小編估計是作者發(fā)掘到很多感興趣的候選lncRNAs，留到后續(xù)研究)。利用上述結果，構建了miRNA介導的調(diào)控網(wǎng)絡和ceRNA網(wǎng)絡，推測circRNA A02:23507399|23531438是在轉錄后水平調(diào)控花藥發(fā)育的重要circRNAs。GO分析表明，miRNAs和circRNAs可以調(diào)節(jié)纖維素、孢粉素、果膠和胰蛋白酶的有序分泌和沉積；脂質(zhì)的及時降解；絨氈層細胞的程序性細胞死亡在花藥發(fā)育中起著關鍵作用。本研究揭示了一個新的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡，它參與了油菜花藥的發(fā)育，豐富了對開花植物細胞質(zhì)雄性不育的理解，為進一步研究circRNA和miRNA在花藥發(fā)育中的作用奠定了基礎。

實驗材料及方法

本文材料為油菜雄性不育系Bcpol97-05A，其保持系為Bcajh97-01B。開花后，鑒定可育和不育植物，將單株植物花序進行取樣，液氮速凍后-75℃保存。利用Trizol提取花序的總RNA。全轉錄組分析的總RNA來自每個株系30棵單株植物的混合，共三個生物重復。在驗證了RNA樣品的質(zhì)量后，使用epicentre Ribo-Zero試劑盒去除rRNA，之后分別構建各類RNA文庫。構建好文庫并質(zhì)控后，利用Illumina Hi-Seq平臺進行測序。使用find_circ等軟件預測circRNA。通過與miRBase中成熟miRNAs的序列進行比對來鑒定已知的miRNAs。使用miRDeep2軟件預測了新的miRNAs。后續(xù)還進行了目標基因預測、GO分析和目標基因的KEGG分析等，并進行了qRT-PCR驗證，最終利用Cytoscape構建miRNA-mRNA和circRNA-miRNA網(wǎng)絡。

實驗結果

油菜細胞質(zhì)雄性不育系的建立

本實驗以可育植株Bcajh97-01B為輪回親本，回交八代選育不育系，最終建立了雄性不育系Bcpol97-05A，其保持系為Bcajh97-01B。與可育系相比，Bcpol97-05A的雄蕊似乎已經(jīng)耗盡了色素，呈現(xiàn)出白化的樣子。它們也枯萎了，沒有成熟的花粉粒。此外，不育系Bcpol97-05A的雄蕊似乎較短，并顯示出相連的花藥(圖1)，其花粉的活力比可育系低，約85%的花粉粒是敗育的(圖2A，B)。DAPI染色，也發(fā)現(xiàn)不育系的花粉形態(tài)異常，核發(fā)育異常(圖2C-F)。實驗還觀察了兩個品系花粉發(fā)育的表型特征。不育系的花藥囊比可育系的小，最終成熟花粉粒比可育系中少得多(圖3)。

圖1、油菜可育系和不育系花的形態(tài)

圖2、油菜可育系和不育系的花粉特性

圖3、油菜可育系和不育系的花藥橫切面

不育系和可育系circRNA的鑒定

通過全基因組測序，研究者從雄性不育系和可育系的花蕾中鑒定并注釋了1443個circRNAs。共有121個circRNAs (圖4A)。其轉錄本廣泛分布在所有10條染色體中(圖4B)。大約12.68%的circRNAs來自chr3，10.46%來自chr6，14.00%來自chr9，而來自其他染色體的circRNAs的百分比都小于10%(圖4C)。circRNAs分為三類，其中外顯子環(huán)狀911個(63.13%)，內(nèi)含子circRNAs 182個(12.61%)，外顯子內(nèi)含子circRNAs 350個(24.26%；圖5A)，其中大部分長度為200-400 bp(圖5B)。

圖4、油菜可育系和不育系中鑒定的circRNA

圖5、油菜可育系和不育系中circRNA特征

可育系與不育系中差異RNAs的鑒定

本研究在不育系中鑒定出31個DEcircRNAs (9個上調(diào)和22個下調(diào))和47個DEmiRNA (6個上調(diào)和41個下調(diào))。我們分別在表1和表2中總結了基于log2FC的前10個脫氧核糖核酸和核糖核酸。此外，與可育系相比，研究者在不育系中檢測到4779個DEmRNAs(1021個上調(diào)和3758個下調(diào))。

表1、與油菜可育系和不育系中差異表達的前10位circRNAs

表2、油菜可育系和不育系差異表達的前10位miRNAs

對DEmRNAs的KEGG途徑富集分析表明，“淀粉和蔗糖代謝”、“苯丙素類生物合成”和“戊糖和葡糖醛酸相互轉化”是最富集的代謝途徑。研究還表明，大多數(shù)脫氧核糖核酸都被注釋為與植物激素信號轉導有關(圖6)。

圖6、油菜可育系和不育系差異表達基因的KEGG途徑富集分析

此外還對DEmRNAs進行了GO分析，分析了差異基因和所有基因二級功能的富集，反映了每個二級功能的狀態(tài)(圖7)。此外，我們分析了每一個GO術語的富集情況，并總結了在“生物過程”類別、“細胞成分”類別和“分子功能”類別中最顯著富集的GO術語。在BP類別中，最重要的三個節(jié)點是植物型細胞壁修飾、花粉管生長和肌動蛋白絲基運動。大多數(shù)差異基因參與花粉壁發(fā)育，包括花粉外壁和胞質(zhì)形成(表3)。

圖7、油菜可育系和不育系差異基因GO分析

表3、油菜可育系和不育系差異表達基因的BP類別前10位

此外，研究者使用相同的不育系和可育系樣品，通過qRT-PCR證實了核糖核酸序列的結果。隨機選擇五個circRNAs、八個miRNAs和八個mRNAs。定量的結果與測序結果一致，這證明了RNA圖譜的高度可靠性(圖8)。

圖8、RNA測序數(shù)據(jù)的qRT-PCR驗證

2.4 .半核糖核酸-半核糖核酸網(wǎng)絡的構建

為了更好地理解雄性不育花藥發(fā)育過程中的基因調(diào)控網(wǎng)絡，本研究使用TargetFinder軟件鑒定了推測的DEmiRNA–DEmRNA相互作用。結果總共獲得了170個DEmiRNA–DEmRNA相互作用。我們選擇了18個miRNAs和37個mRNAs的DEmiRNA–DEmRNA對，其中miRNAs和相應的mRNAs具有相反的表達，并利用Cytoscape構建了miRNA介導的調(diào)控網(wǎng)絡(圖9)。為了研究miRNAs的潛在功能，對該網(wǎng)絡中假定的靶基因進行了GO分析(圖10)。

圖9、油菜可育系和不育系花藥發(fā)育中的DEmiRNA-DEmRNA網(wǎng)絡圖

圖10、油菜可育系和不育系DEmiRNA-DEmRNA網(wǎng)絡中miRNAs潛在靶標的GO分類

DEcircRNA–DEmiRNA–DEmRNA網(wǎng)絡的構建

通過TargetFinder軟件，在不育系中獲得了兩個由一個上調(diào)的circRNA(A02:23507399|23531438)和兩個下調(diào)的miRNA(非保守_A02_5092和非保守_A07_27586)靶基因組成的DEcircRNA–DEmiRNA相互作用。為了研究ceRNA在花藥發(fā)育中的調(diào)控，并鑒定與花藥發(fā)育相關的circRNA，構建了DEcircRNA–DEmiRNA–DEmRNA網(wǎng)絡。最終，通過分析，構建了一個ceRNA網(wǎng)絡，由一個circRNA、兩個miRNAs、五個mRNAs(Bra006799、Bra013352、Bra022668、Bra029377和Bra038700)和10個交互對組成(圖11)。

圖11、油菜可育系和不育系花藥發(fā)育中的決定DEcircRNA-DEmiRNA-DEmRNA三重網(wǎng)絡

結論

本研究通過全轉錄組測序，鑒定了幾種與花藥發(fā)育相關的RNAs，包括mRNA、circRNA和miRNA，還重建了涉及這些RNA分子的假定調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，這將加深和豐富人們對花藥發(fā)育和雄性生育控制的理解。此外，對ceRNA網(wǎng)絡的解析，為花藥發(fā)育過程中RNA的調(diào)控作用提供新的視角。

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全轉錄組測序技術優(yōu)勢：

• rRNA去除建庫，保留了完整的RNA種類信息；
•  鏈特異性文庫，可以保留轉錄本的鏈信息，更準確地檢測反義RNA；
• 使用高通量測序，能夠獲得更加全面的RNA信息，包括低豐度的RNA；
• 通過測定的序列信息精確地分析不同類型RNA的表達豐度變化及其生物學功能；
• 分析同一樣本中的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA四種類型RNA，明確這些RNA之間的共表達和調(diào)控關系，揭示ceRNA調(diào)控機制。

關于天昊：

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