【昊閱讀】10X Genomics單細(xì)胞測(cè)序揭示動(dòng)脈粥樣硬化疾病中的保護(hù)機(jī)制

發(fā)稿時(shí)間：2019-10-08來(lái)源：天昊生物

英文題目：Atheroprotective roles of smooth muscle cell phenotypic modulation and the TCF21 disease gene as revealed by single-cell analysis

中文題目：10X Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序提示平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化與疾病候選基因TCF21在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中的保護(hù)作用

IF：30.641

發(fā)表時(shí)間：Volume 25 Issue 8, August 2019

作者信息：美國(guó)斯坦福大學(xué)醫(yī)學(xué)院

研究背景

※ 冠狀動(dòng)脈疾病（CAD）的最嚴(yán)重后果往往是由于"不穩(wěn)定"的動(dòng)脈粥樣硬化病變斑塊破裂，進(jìn)而觸發(fā)血栓閉塞，最終導(dǎo)致心肌梗死。與穩(wěn)定的冠狀動(dòng)脈病變相比，這些脆弱的病變斑塊的特點(diǎn)是較大的壞死脂質(zhì)核心和外層較薄的纖維帽結(jié)構(gòu)。

※ 為響應(yīng)各種刺激，血管平滑肌細(xì)胞（SMC）可以去分化、增殖和遷移，這一過(guò)程被稱為表型轉(zhuǎn)化。然而，動(dòng)脈粥樣硬化時(shí)SMC的體內(nèi)表型轉(zhuǎn)化以及該過(guò)程對(duì)冠狀動(dòng)脈疾?。–AD）風(fēng)險(xiǎn)的影響尚不明確。傳統(tǒng)認(rèn)知，人們認(rèn)為纖維帽的最內(nèi)層如果存在更多的平滑肌細(xì)胞，那么動(dòng)脈粥樣硬化斑塊就更加穩(wěn)定，CAD的危險(xiǎn)就越小。而近年的研究發(fā)現(xiàn)，血管平滑肌細(xì)胞(SMCs)極有可能通過(guò)表型轉(zhuǎn)化的模式參與脆弱斑塊的形成，并且通過(guò)表型轉(zhuǎn)化進(jìn)一步破壞病變的穩(wěn)定性。

※ 前期研究還發(fā)現(xiàn)，斑塊區(qū)的大部分平滑肌細(xì)胞不能被鑒定出（因?yàn)閙arker基因表達(dá)下調(diào)），一些平滑肌細(xì)胞被錯(cuò)誤地鑒定為被稱作巨噬細(xì)胞的免疫細(xì)胞，而一些源自巨噬細(xì)胞的細(xì)胞也能夠偽裝成平滑肌細(xì)胞。此外，一部分平滑肌細(xì)胞可轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃朴诟杉?xì)胞和肌纖維母細(xì)胞的細(xì)胞。這些研究結(jié)果提示斑塊區(qū)內(nèi)的細(xì)胞組成非常混亂。

 ※ TCF21 是一種轉(zhuǎn)錄因子編碼基因，是CAD的一個(gè)致病基因，位于基因組6q23.2。這個(gè)基因如何參與斑塊形成，如何參與CAD發(fā)病的具體機(jī)制仍然存在很多未知領(lǐng)域。

主要研究方法

※ 建立小鼠品系，應(yīng)用血管平滑肌譜系跟蹤的試驗(yàn)技術(shù)（lineage tracing），從而達(dá)到追蹤血管平滑肌的目的。

※ 建立Tcf21 knockout小鼠模型。

※小鼠主動(dòng)脈根/上升主動(dòng)脈細(xì)胞分離；人類冠狀動(dòng)脈細(xì)胞分離。

※分選后10X Chromium單細(xì)胞測(cè)序：熒光激活細(xì)胞分選 （FACS）方法將從主動(dòng)脈根和上升主動(dòng)脈分離的細(xì)胞分為兩組：tdT+（SMC origin細(xì)胞）和 tdT-（所有其他細(xì)胞）(基線；高脂飲食8周；高脂飲食16 周三個(gè)時(shí)間點(diǎn))

※ CITE-seq(Cellular Indexing ofTranscriptomes and Epitopes by sequencing,通過(guò)測(cè)序來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組和表位的細(xì)胞索引技術(shù))的新型測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)單細(xì)胞表面成千上萬(wàn)個(gè)表面蛋白標(biāo)記物。

※  RNAscope原位RNA檢測(cè)。

研究結(jié)果

?單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-Seq）確定了小鼠動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程的血管細(xì)胞組成：主要可分為SMC1和SMC2兩個(gè)類群，而隨著CAD病情的發(fā)展，出現(xiàn)了一組粉紅色類群細(xì)胞---SMC表型轉(zhuǎn)化類群（圖abc），而且這個(gè)類群的細(xì)胞絕大多數(shù)為SMC來(lái)源（圖d，即SMC轉(zhuǎn)化而來(lái)）。同時(shí)，研究者發(fā)現(xiàn)Tcf21表達(dá)在 SMC 表型轉(zhuǎn)化過(guò)程中上調(diào)（圖f）。                                    

圖abc：小鼠主動(dòng)脈根在基線，8周高脂，16周高脂飲食后的單細(xì)胞測(cè)序結(jié)果，可以看出粉紅色類群細(xì)胞---SMC表型轉(zhuǎn)化類群逐漸出現(xiàn)。
圖d:所有時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞混合后，按是否是SMC origin來(lái)源分組?？梢姡虚g多個(gè)細(xì)胞類群，包括隨疾病發(fā)生而出現(xiàn)的SMC表型轉(zhuǎn)化類群，都是SMC來(lái)源的細(xì)胞。圖e: 每個(gè)細(xì)胞類群的表達(dá)最高的8個(gè)基因。圖f：Tcf21+細(xì)胞在不同細(xì)胞類型細(xì)胞群中的占比。

?在體研究發(fā)現(xiàn)，SMC表型轉(zhuǎn)化可形成獨(dú)特的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，被命名為“fibromyocyte”，而不是轉(zhuǎn)化為經(jīng)典理論中的巨噬細(xì)胞表型。

圖a: 小鼠主動(dòng)脈根在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的總體細(xì)胞類群圖
圖b-f：按某個(gè)基因表達(dá)高低標(biāo)記細(xì)胞類群圖g: 按SMC轉(zhuǎn)化分值標(biāo)記細(xì)胞（分越高，表示轉(zhuǎn)化程度越高）圖h：Tagln表達(dá)水平變化和差異圖 i：細(xì)胞類群變化的方向圖j：SMC轉(zhuǎn)化過(guò)程中差異基因最富集的通路
?SMC中特異性敲除TCF21基因，單細(xì)胞測(cè)序提示fibromyocyte細(xì)胞占比顯著下降，提示該基因敲除能夠顯著抑制小鼠中的SMC表型轉(zhuǎn)化，從而導(dǎo)致病變斑塊內(nèi)以及病變斑塊的保護(hù)性纖維帽內(nèi)存在較少的fibromyocyte。

圖：針對(duì)SMC中特異性敲除TCF21前后，小鼠SMC轉(zhuǎn)化后的fibromyocyte（即SMC轉(zhuǎn)化后細(xì)胞）的占比下降

?在人類冠狀動(dòng)脈觀察到了類似的SMC轉(zhuǎn)化和成纖維肌細(xì)胞表型。

圖a：人冠狀動(dòng)脈單細(xì)胞測(cè)序后的細(xì)胞類群
圖b-e：按基因表達(dá)高低標(biāo)記細(xì)胞圖f：TNFRSF11B（fibromyocyte的一個(gè)marker）的RNA原位檢測(cè)

?TCF21 與 人類冠狀動(dòng)脈SMC 表型轉(zhuǎn)化相關(guān)：通過(guò)關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)，SMC分化后的marker與TCF21的表達(dá)負(fù)相關(guān)，提示TCF21高表達(dá)與SMC去分化有關(guān)，即TCF21表達(dá)與患者冠狀動(dòng)脈中的SMC表型轉(zhuǎn)化顯著相關(guān)。

圖a: 與TCF21表達(dá)正相關(guān)的代表基因和負(fù)相關(guān)的代表基因。
圖b：正相關(guān)基因集中于轉(zhuǎn)化后的SMC，負(fù)相關(guān)基因集中于未轉(zhuǎn)化的SMC。

?CAD 風(fēng)險(xiǎn)堿基個(gè)數(shù)與 TCF21 表達(dá)減少相關(guān)，提示TCF21表達(dá)升高和SMC表型轉(zhuǎn)化在CAD疾病中的保護(hù)作用。

圖a：7個(gè)CAD基因組顯著性SNP位點(diǎn)
圖b：CAD 風(fēng)險(xiǎn)堿基個(gè)數(shù)與 TCF21 表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)

研究結(jié)論

使用單細(xì)胞RNA測(cè)序，本研究全面描述了在小鼠和人類動(dòng)脈粥樣硬化病變動(dòng)脈中存在SMC的表型轉(zhuǎn)化，并且發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞轉(zhuǎn)化為獨(dú)特的成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞，被稱為"纖維肌細(xì)胞"，而不是傳統(tǒng)認(rèn)為的經(jīng)典的巨噬細(xì)胞表型。SMC 中特異性敲除TCF21 基因，表現(xiàn)出顯著的小鼠SMC 表型轉(zhuǎn)化抑制，導(dǎo)致小鼠體內(nèi)病變處和保護(hù)纖維帽內(nèi)的纖維肌細(xì)胞減少。此外，TCF21 表達(dá)與患病人類冠狀動(dòng)脈的SMC表型轉(zhuǎn)化顯著相關(guān)，高TCF21表達(dá)水平與人類CAD低患病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。這些結(jié)果確立了TCF21和SMC表型轉(zhuǎn)化在該疾病中的保護(hù)作用。