單細(xì)胞基因表達(dá)入門之實(shí)驗(yàn)規(guī)劃指南

發(fā)稿時間：2019-09-12來源：天昊生物

為什么要進(jìn)行單細(xì)胞基因表達(dá)分析？

跳出傳統(tǒng)的基因表達(dá)分析，逐個細(xì)胞地表征細(xì)胞群體，細(xì)胞類型和細(xì)胞狀態(tài)等信息

過去，各種生物體、組織和疾病狀態(tài)中的基因表達(dá)差異已經(jīng)可以利用多種方法來鑒定，比如芯片和大量細(xì)胞的RNA測序（RNA-seq）。這些方法通常需要數(shù)百至數(shù)百萬個細(xì)胞作為起始材料，但是只能得到整個細(xì)胞群體的平均信息。發(fā)育生物學(xué)、癌癥、神經(jīng)科學(xué)、免疫學(xué)和傳染病中的復(fù)雜生物學(xué)過程往往涉及到多個單細(xì)胞，它們具有不同的細(xì)胞命運(yùn)、狀態(tài)和功能。對于這些動態(tài)的細(xì)胞事件，大量細(xì)胞的檢測只能提供有限的信息，因?yàn)閱蝹€細(xì)胞的信息已經(jīng)淹沒在其中(Griffiths J.A. et al, Mol Syst Biol, 2018)（圖1）。

最近，單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)，包括我們的高通量Chromium單細(xì)胞基因表達(dá)解決方案（Chromium Single Cell Gene Expression Solution），能夠在單細(xì)胞水平上直接測定基因表達(dá)，從而定量細(xì)胞內(nèi)的群體異質(zhì)性，并逐個鑒定細(xì)胞類型、細(xì)胞狀態(tài)和動態(tài)細(xì)胞躍遷。除了有望鑒定新的細(xì)胞亞型和稀有細(xì)胞群體，單細(xì)胞技術(shù)還能更好地了解轉(zhuǎn)錄動態(tài)和基因調(diào)控關(guān)系。
盡管在單細(xì)胞RNA-seq和大量細(xì)胞表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，每個樣本所測序的轉(zhuǎn)錄本數(shù)目是相似的，但單細(xì)胞基因表達(dá)研究可以讓您從傳統(tǒng)的整體標(biāo)志物基因分析延伸到細(xì)胞類型或細(xì)胞狀態(tài)的鑒定以及伴隨的調(diào)控通路中動態(tài)變化的鑒定，這是由多個基因驅(qū)動的。重要的是，單細(xì)胞基因表達(dá)還能實(shí)現(xiàn)細(xì)胞群體的無偏向鑒定，而不需要細(xì)胞亞型或細(xì)胞標(biāo)志物的任何先驗(yàn)知識。為了充分利用單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組技術(shù)所帶來的豐富知識，您在第一次開始實(shí)驗(yàn)之前應(yīng)當(dāng)考慮有關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、樣本制備和下游數(shù)據(jù)分析的一些相關(guān)步驟。本指南將幫助您開展單細(xì)胞基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)，并充當(dāng)路線圖，幫助您設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化實(shí)驗(yàn)參數(shù)，并確定計(jì)算/分析工具，以便更好地分析您的單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)。

準(zhǔn)備單細(xì)胞基因表達(dá)實(shí)驗(yàn)

需要考慮哪些因素？

Step1

我想回答哪些科學(xué)問題？

單細(xì)胞基因表達(dá)分析可以為許多不同類型的研究問題提供答案。這些問題包括但不限于：
A. 我想表征、鑒定、繪制或登記組織或器官中的混合細(xì)胞群體

B. 我想表征或鑒定復(fù)雜細(xì)胞過程中所涉及的新穎生物標(biāo)志物或調(diào)控通路

C. 我想表征或鑒定復(fù)雜細(xì)胞過程中所涉及的新穎細(xì)胞類型或狀態(tài)

Step2

制備和處理樣本的最佳做法是什么？

A. 樣本類型 & 制備

關(guān)鍵是您要獲得分離良好的細(xì)胞懸液、無細(xì)胞碎片、極少細(xì)胞團(tuán)塊，且細(xì)胞活力高（>70%）。了解您所研究細(xì)胞的大小范圍也很重要。細(xì)胞大小通常與細(xì)胞表達(dá)的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量有關(guān)。各種尺寸不同的細(xì)胞（直徑高達(dá)>30 μm）均可與我們基因表達(dá)解決方案中使用的Chromium單細(xì)胞芯片兼容。

一般來說，細(xì)胞制備方案將根據(jù)組織來源和細(xì)胞類型而變化。每種組織類型都是獨(dú)特的，因此，必須在開始任何單細(xì)胞實(shí)驗(yàn)之前優(yōu)化樣本制備（最佳的樣本制備指南詳見：go.10xgenomics.com/scRNA-3/optimal-sample-prep）。冷凍保存、固定（詳見甲醇固定的演示方案：go.10xgenomics.com/scRNA-3/methanol-fixation)，以及從長期保存的樣本中分離細(xì)胞核（詳見細(xì)胞核分離的演示方案：go.10xgenomics.com/scRNA-3/nuclei-isolation）這些替代的制備方案也與我們的系統(tǒng)兼容。

B. 樣本處理

在分離或組織解離后快速處理樣本的能力對維持細(xì)胞完整性和保留每個細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組至關(guān)重要。請注意，任何樣本操作都有可能對基因表達(dá)譜、細(xì)胞狀態(tài)或細(xì)胞活力產(chǎn)生不利影響，并在研究中引入偏好性(Van Den Brick S.C. et al, Nat. Met, 2017)。

Step3

我的實(shí)驗(yàn)需要多少細(xì)胞和重復(fù)？

B. 測序深度每個實(shí)驗(yàn)的測序深度取決于單個細(xì)胞中的mRNA總量和這些細(xì)胞中mRNA種類的多樣性。通常而言，在轉(zhuǎn)錄本多樣性相同的情況下，表達(dá)少量mRNA的細(xì)胞比表達(dá)大量mRNA的細(xì)胞所需的測序深度要低得多。當(dāng)測序成本或通量受限時，通常需要在測序較多的細(xì)胞（寬度）和以更多的reads測序較少的細(xì)胞（深度）之間進(jìn)行權(quán)衡。閱讀技術(shù)指南，了解更多信息 ：go.10xgenomics.com/scRNA-3/number-and-depth。10x Genomics的單細(xì)胞基因表達(dá)文庫與短讀長測序儀兼容。此外，我們的方案利用獨(dú)特的分子標(biāo)識符（UMI）在擴(kuò)增發(fā)生之前對每個轉(zhuǎn)錄本分子進(jìn)行編碼，從而在考慮到PCR擴(kuò)增偏好性的前提下生成數(shù)字基因表達(dá)譜。

C. 重復(fù)數(shù)量重復(fù)數(shù)量取決于研究項(xiàng)目、樣本類型、以及研究所需的細(xì)胞數(shù)量。生物學(xué)重復(fù)仍然是業(yè)界一個有爭議的問題。在一些研究中，一個樣本就已經(jīng)足夠，其中每個細(xì)胞代表了一個生物學(xué)重復(fù)，而不同個體的不同樣本則解釋了特定生物學(xué)過程的差異。在另一些研究中，為了減少小細(xì)胞群體隨時間發(fā)生的生物學(xué)變化，混合不同樣本中的細(xì)胞以覆蓋所研究細(xì)胞群體的各個方面也許是有好處的。在其他的情況下，可能需要使用一個樣本的多個重復(fù)，以增加研究中的細(xì)胞總數(shù)。

D. 批次效應(yīng)批次效應(yīng)可能在工作流程的任何階段引入，主要是后勤方面的限制，導(dǎo)致不同的制備時間、操作人員和處理方案。10x Genomics的Chromium系統(tǒng)在各種技術(shù)重復(fù)中表現(xiàn)出最好的技術(shù)穩(wěn)定性（詳見技術(shù)指南：go.10xgenomics.com/scRNA-3/technicalreplicates）。在合并多個文庫的數(shù)據(jù)時，我們建議在合并之前平衡各個文庫的讀取深度（深度歸一化），以便減少測序引入的批次效應(yīng)（詳見技術(shù)指南 ：go.10xgenomics.com/scRNA-3/depthnormalization）。此外，許多計(jì)算工具，包括Seurat，Scran和Scrone，也能糾正批次效應(yīng)。

Step4

我該如何分析和可視化我的數(shù)據(jù)？

B. 數(shù)據(jù)可視化Loupe Cell Browser是一款桌面應(yīng)用程序，適用于快速、交互式的單細(xì)胞數(shù)據(jù)可視化和分析。為了加速新的標(biāo)志物基因的探索，您可以鑒定稀有的細(xì)胞類型，探索數(shù)據(jù)中的新型子結(jié)構(gòu)，而不需要事先掌握編程知識（詳見在線教程 go.10xgenomics.com/scRNA-3/visualization-tutorial）。

Cell Ranger pipeline生成的輸出文件可以通過大部分以R或Python語言開發(fā)的開源軟件包來解釋分析。單細(xì)胞基因表達(dá)分析最常用的一些軟件包是Seurat和Monocle。如果您具有編程基礎(chǔ)，則可通過這兩種R語言軟件包開展QC檢驗(yàn)、二次分析以及對單細(xì)胞基因表達(dá)數(shù)據(jù)的探索（詳見 github.com/seandavi/awesome-single-cell或www.scrna-tools.org網(wǎng)站所列軟件包）。

關(guān)于天昊

天昊生物具有多年基因組、轉(zhuǎn)錄組和表觀組等多組學(xué)檢測與分析的經(jīng)驗(yàn)，現(xiàn)推出的10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序可為您提供專業(yè)的科研服務(wù)及個性化的單細(xì)胞信息挖掘，期待成為您單細(xì)胞測序分析的優(yōu)質(zhì)服務(wù)提供商！

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