經(jīng)典的m6A RNA甲基化研究案例

發(fā)稿時間：2019-08-20來源：天昊生物

文章標(biāo)題：METTL3 facilitates tumor progression via an m6A-IGF2BP2-dependent mechanism in colorectal carcinoma

發(fā)表雜志：Molecular Cancer

影響因子：10.679

發(fā)表時間：2019年6月

 

中山大學(xué)腫瘤防治中心徐瑞華教授和鞠懷強(qiáng)教授團(tuán)隊(duì)在結(jié)直腸癌（CRC）中發(fā)現(xiàn)METTL3能夠基于m6A-IGF2BP2的機(jī)制促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。鑒于結(jié)直腸癌中并未有太多關(guān)于m6A RNA甲基化修飾的報道，本研究首次在結(jié)直腸中證實(shí)了METTL3促癌的功能。

 

主要研究結(jié)果

 

1. METTL3在轉(zhuǎn)移性CRC中高表達(dá)且與不良預(yù)后相關(guān)

首先在TCGA數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)多個m6A相關(guān)‘寫蛋白/擦除蛋白/讀蛋白’的表達(dá)水平在結(jié)腸癌中異常表達(dá)(Fig.1a)，qPCR驗(yàn)證了其表達(dá)水平(Fig.1b)。由于METTL3在多個癌種中被證實(shí)高表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)METTL3在復(fù)發(fā)性CRC組織和轉(zhuǎn)移性肝組織也呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)(Fig.1c)，而且mRNA和蛋白水平在CRC細(xì)胞系也顯示上調(diào)(Fig.1d-e)。

METTL3蛋白水平在CRC患者中表達(dá)上調(diào)(Fig.1f)，免疫組化結(jié)果驗(yàn)證了METTL3在CRC組織、淋巴結(jié)和肝轉(zhuǎn)移組織中都顯示出高表達(dá)(Fig.1g-h)。更重要的是，METTL3高表達(dá)的患者化療效果更差(Fig.1i)，整體生存率和無病生存率更低(Fig.1j)。

 

2. SOX2受METTL3介導(dǎo)的m6A修飾調(diào)控

METTL3在SW620細(xì)胞中顯示比SW480中具有更高的表達(dá)（兩種細(xì)胞系具有不同的轉(zhuǎn)移潛能，Fig.2a），然后利用MeRIP-seq和RNA-seq在SW480、SW620和METTL3敲降的SW620細(xì)胞中尋找潛在的靶點(diǎn)。綜合分析差異的甲基化peak和表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與SW480細(xì)胞相比，SW620細(xì)胞中733個高甲基化peak同時具有更高的表達(dá)水平；在敲降的細(xì)胞中3393個低甲基化peak具有更低的表達(dá)水平(Fig.2b)。從這兩組結(jié)果中發(fā)現(xiàn)192個特異性的peak被共享(Fig.2c)，與158個基因相關(guān)，通路富集發(fā)現(xiàn)這些可能參與干細(xì)胞分化的通路中(Fig.2d)。

進(jìn)一步對候選的基因分析發(fā)現(xiàn)四個基因SEMA3A、BCHE、ZFP36L2和SOX2在SW620細(xì)胞中顯示出m6A修飾的大幅增加，而在敲降細(xì)胞中顯示一致的減少(Fig.2e)。然而m6A-qPCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)SOX2的m6A水平在敲降細(xì)胞中下降得最顯著，因此SOX2可能作為METTL3的潛在靶點(diǎn)參與到促進(jìn)CRC干性和轉(zhuǎn)移過程中(Fig.2f-h)。

 

3. 體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)METTL3促進(jìn)CRC細(xì)胞干性

在METTL3敲降的SW620細(xì)胞中球體數(shù)目(Fig.3a-b)、菌落形成、侵襲能力均受影響(Fig.3c)，而對奧沙利鉑的化療敏感性增加(Fig.3d)，癌癥干細(xì)胞表面抗原CD133、CD44和EpCAM在METTL3被抑制后顯著下降(Fig.3e)，同時METTL3下游基因也被顯著抑制(Fig.3f)，另外SOX2過表達(dá)能夠rescue干性下降的表型(Fig.3g-i)。這些結(jié)果表明METTL3在CRC細(xì)胞中的致癌的角色，主要通過維持SOX2的表達(dá)實(shí)現(xiàn)促進(jìn)腫瘤的自我更新、細(xì)胞侵入和化療抗性。

 

4. 體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)METTL3驅(qū)動CRC腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移

通過異種移植實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)METTL3敲降的細(xì)胞移植后腫瘤生長速率下降、腫瘤體積減小(Fig.4a-b)；免疫組化發(fā)現(xiàn)尾靜脈注射對照組SW620細(xì)胞的小鼠會出現(xiàn)更多的肺轉(zhuǎn)移結(jié)節(jié)(Fig.4c)。同樣地，SOX2過表達(dá)能夠rescue腫瘤形成的功能(Fig.4d)。利用PDX模型瘤內(nèi)注射siRNA評價METTL3的治療作用，主要結(jié)果也與上述一致(Fig.4e-h)。因此，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)確實(shí)證實(shí)了METTL3在CRC中的成瘤和轉(zhuǎn)移作用。

 

5. IGF2BP2基于m6A修飾的方式增加SOX2 mRNA穩(wěn)定性

先前有研究發(fā)現(xiàn)兩類m6A讀蛋白（readers）家族可能控制著甲基化修飾的mRNA的命運(yùn)，如YTH家族和IGF2BP家族。為了揭示SOX2特定的m6A readers，利用鏈霉親和素RNA pull down實(shí)驗(yàn)檢測相關(guān)的readers，發(fā)現(xiàn)IGF2BP2特異性地結(jié)合在SOX2全長轉(zhuǎn)錄本上，而非IGF2BP家族其它成員或YTH家族(Fig.5a)。而且pull down實(shí)驗(yàn)也證實(shí)了IGF2BP2主要結(jié)合在CDS區(qū)，在motif缺失后特定的結(jié)合也會受到影響(Fig.5b)。RIP實(shí)驗(yàn)同樣地證實(shí)了IGF2BP2和SOX2 mRNA之間直接的影響(Fig.5c)。

在抑制IGF2BP2后SOX2蛋白和mRNA水平、SOX2下游基因表達(dá)水平均受到顯著抑制，IGF2BP2和SOX2轉(zhuǎn)錄本之間的作用也會受到METTL3的影響(Fig.5d-h)。在抑制METTL3或IGF2BP2后，SOX2 mRNA表達(dá)水平開始下降，而且其半衰期顯著變短(Fig.5i-j)。這些結(jié)果都能說明IGF2BP2確實(shí)充當(dāng)reader的角色，維持SOX2轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定性。

 

6. METTL3/SOX2/ IGF2BP2在CRC中的臨床相關(guān)性

基于以上機(jī)制的發(fā)現(xiàn)，利用臨床樣本分析METTL3/SOX2/IGF2BP2之間的相關(guān)性，包括免疫組化實(shí)驗(yàn)、表達(dá)相關(guān)性，利用三個marker的IHC數(shù)據(jù)對CRC患者進(jìn)行預(yù)后的預(yù)測，三者的高表達(dá)顯示了最差的預(yù)后，因此可以建立一個很好的預(yù)測模型(Fig.6)。

 

 

研究總結(jié)

本研究發(fā)現(xiàn)了METTL3對于CRC進(jìn)展的關(guān)鍵作用及可能基于m6A的機(jī)制，METTL3-IGF2BP2-SOX2之間的調(diào)控作用是基于m6A這一表觀調(diào)控機(jī)制來實(shí)現(xiàn)的，另外PDX模型顯示METTL3作為潛在靶點(diǎn)可能具有一定的治療作用。

 

 

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