天昊微生物項(xiàng)目文章：青藏高原東部冰川消退后稀有和豐富細(xì)菌亞群的獨(dú)特共生模式和驅(qū)動(dòng)力

發(fā)稿時(shí)間：2019-08-19來源：天昊生物

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院近期在《Biology and Fertility of Soils》上發(fā)表了青藏高原東部冰川消退后稀有和豐富細(xì)菌亞群的獨(dú)特共生模式和驅(qū)動(dòng)力的文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的相對(duì)定量擴(kuò)增子測(cè)序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Distinct co-occurrence patterns and driving forces of rare and abundant bacterial subcommunities following a glacial retreat in the eastern Tibetan Plateau

中文題目：青藏高原東部冰川消退后稀有和豐富細(xì)菌亞群的獨(dú)特共生模式和驅(qū)動(dòng)力

期刊名：Biology and Fertility of Soils

影響因子： 4.829

發(fā)表時(shí)間： 2019年 

研究概要：

為了深入了解豐富和稀有細(xì)菌的生態(tài)和進(jìn)化過程，必須揭示它們?cè)诒?/span>消退中的動(dòng)態(tài)和驅(qū)動(dòng)力。在此，我們利用Illumina序列數(shù)據(jù)集研究了海螺溝冰川時(shí)間序列中土壤發(fā)育不同階段相關(guān)的豐富和稀有細(xì)菌的生態(tài)豐度、演替動(dòng)力學(xué)和共生模式。豐富細(xì)菌類群表現(xiàn)為普遍分布和緊密聚集，而稀有細(xì)菌類群則表現(xiàn)為沿演替階段分布不均和松散聚集。豐富細(xì)菌和稀有細(xì)菌亞群落在裝配過程中都受到不同因素的驅(qū)動(dòng)：生物和土壤因子的相互作用是主要的驅(qū)動(dòng)力，盡管對(duì)稀有細(xì)菌類群的重要性不如對(duì)豐富細(xì)菌類群的重要性。特別是，冗余分析和結(jié)構(gòu)方程模型表明，土壤有機(jī)碳、ph和植物豐富度主要影響豐富細(xì)菌亞群，而土壤氮和pH對(duì)稀有細(xì)菌亞群落影響最大。更重要的是，與生物因子相比，土壤因子對(duì)豐富細(xì)菌（7.8%）和稀有細(xì)菌（4.5%）亞群落的影響稍大。與其它時(shí)間序列階段相比，豐富的和稀有的細(xì)菌在中間階段表現(xiàn)出更為緊湊的網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。在稀有類群中，重疊節(jié)點(diǎn)是豐富類群（Proteobacteria和Acidobacteria），和稀有類群（Planctomycetia,Sphingobacteriia, Phycisphaerae）。此外，網(wǎng)絡(luò)分析表明，與稀有類群相比，豐富類群表現(xiàn)出更為密切的關(guān)系，對(duì)群落中其它共現(xiàn)現(xiàn)象的影響也更大。這些發(fā)現(xiàn)共同揭示了青藏高原東部冰川時(shí)間序列沿線豐富和稀有細(xì)菌亞群的不同共生模式和驅(qū)動(dòng)力。

研究背景：

由全球變暖引起的冰川消退對(duì)生態(tài)系統(tǒng)有著深遠(yuǎn)和多重的影響，包括地表和地下的群落組成。土壤微生物是地下生態(tài)系統(tǒng)的獨(dú)特組成部分，是土壤生物地球化學(xué)過程和生態(tài)功能的關(guān)鍵參與者，因此，其空間組成和分布格局的變化對(duì)環(huán)境波動(dòng)的響應(yīng)可能直接影響生態(tài)系統(tǒng)的功能。隨著分子工具的發(fā)展，對(duì)微生物跨時(shí)空的生態(tài)和進(jìn)化過程的研究越來越受到重視，特別是在一些嚴(yán)酷而原始的生態(tài)系統(tǒng)中，包括苔原和冰川消退區(qū)。例如，zumsteg等人認(rèn)為豐富的細(xì)菌類群受冰川壩土壤水分、酸堿度和離子濃度的影響。Knelman等人發(fā)現(xiàn)，許多微生物在最近除冰的土壤中具有活性（或潛在的活性），能夠快速利用可用的營養(yǎng)物質(zhì)或氣相沉積的富碳底物（例如花粉）。這些早期的研究主要集中在高度包容性類群（域和界水平）和環(huán)境因素對(duì)土壤群落組成的影響，而忽略了哪些較少和較不包容性類群以及微生物物種之間的相互作用。這些群落被稱為稀有生物圈，豐度較低，多樣性極高。Yan等人建議，為了理解微生物的演替動(dòng)力學(xué)，僅分析域和界水平類群是不夠的，應(yīng)該同時(shí)調(diào)查包容（域和界水平）和不太包容的類群（如稀有類群），以便更好地分析群落動(dòng)力學(xué)。最近基于網(wǎng)絡(luò)分析的研究已經(jīng)證明了豐富和罕見的微生物之間的相互作用在確定群落組成中的重要作用。然而，對(duì)于發(fā)展中的土壤（<200年）中微生物群落的相互作用和組裝機(jī)制的了解仍然有限，特別是在冰川消退之后。

微生物群落由少數(shù)高度豐富的物種和大量的稀有物種組成，后一亞群仍有很大程度的未被開發(fā)，在大多數(shù)生態(tài)系統(tǒng)中，豐富的微生物有助于細(xì)菌生物量的產(chǎn)生和有機(jī)質(zhì)的流動(dòng)，而以少數(shù)個(gè)體為代表的眾多珍稀物種提供了巨大的遺傳多樣性和功能多樣性儲(chǔ)備，可以增強(qiáng)豐富微生物的功能，調(diào)節(jié)生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性和功能。豐富和罕見的群落組合可能受到不同的控制因素的影響。然而，由于以往方法的局限性，很難直接識(shí)別稀有和豐富的微生物，也很難探索這些亞群的微生物多樣性，此外，為了應(yīng)對(duì)環(huán)境變化，探索稀有微生物群落的動(dòng)態(tài)變化尤其具有挑戰(zhàn)性；它們可以以非常小的規(guī)模上占據(jù)多個(gè)生態(tài)位。目前，高通量測(cè)序技術(shù)的快速發(fā)展大大提高了我們識(shí)別不同類型微生物的能力，并探索了它們?cè)诓煌鷳B(tài)系統(tǒng)中的多樣性和動(dòng)態(tài)性。

盡管在不同的生態(tài)系統(tǒng)中，微生物的分布已被廣泛研究，但隨著時(shí)間的推移，關(guān)于微生物群落分布過程的驅(qū)動(dòng)因素仍然存在爭(zhēng)論。近年來，一些研究比較了不同環(huán)境因子對(duì)不同生態(tài)系統(tǒng)中豐富和稀有類群的相對(duì)影響。例如，Yan等人揭示了稀有細(xì)菌對(duì)變化條件的敏感性低于冰川消退初期豐富細(xì)菌對(duì)變化條件的敏感性。Jiao等人發(fā)現(xiàn)，在石油污染土壤中，稀有和豐富細(xì)菌的聚集受不同因素的驅(qū)動(dòng)。稀有類群主要受隨機(jī)過程的影響，而豐富的類群主要受土壤因子的控制。相反，Gobet等人發(fā)現(xiàn)在沿海沙地養(yǎng)分脅迫下，稀有和豐富的細(xì)菌類群都受到類似環(huán)境因素的影響。因此，當(dāng)暴露于環(huán)境變化，特別是在發(fā)展中的生態(tài)系統(tǒng)中時(shí)，與豐富的類群相比，稀有類群是否表現(xiàn)出截然不同的生物多樣性模式或不同的生態(tài)響應(yīng)尚不清楚。

盡管我們知道微生物群落的多樣性和組成是由環(huán)境條件驅(qū)動(dòng)的，但我們對(duì)微生物類群之間復(fù)雜相互作用的理解仍然有限。一種解決方案可能是使用基于網(wǎng)絡(luò)分析的方法，這已被證明是檢驗(yàn)微生物群落內(nèi)復(fù)雜相互作用（例如共生、寄生、競(jìng)爭(zhēng)和捕食）的一種強(qiáng)有力的方法。網(wǎng)絡(luò)的不同拓?fù)涮卣鳎ㄈ缍?、中間中心性、復(fù)雜性、模塊性和聚類系數(shù)）可用于識(shí)別關(guān)鍵物種和評(píng)估微生物群落的穩(wěn)定性。例如，高中間中心性表示網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)的核心和中心位置，而低中間中心性表示外圍位置。此外，某些交互鏈接的存在或不存在可能是交互系統(tǒng)特定緊密性的有力指標(biāo)。雖然已經(jīng)開展了一些研究來研究受非生物和/或生物因素影響的微生物網(wǎng)絡(luò)相互作用，但很少有研究將稀有和豐富類群的亞群落的共生網(wǎng)絡(luò)模式與非生物和/或生物條件的變化聯(lián)系起來，尤其是在冰川。通過下一代測(cè)序，大多數(shù)的研究集中在冰川前沿時(shí)間序列的年輕年輪序列（<200年）中的豐富細(xì)菌群落，然而，很少研究罕見生物圈和微生物群相互作用的重要性。在這項(xiàng)研究中，我們對(duì)脫冰層土壤中的稀有和豐富的亞群落進(jìn)行了網(wǎng)絡(luò)分析，以加深對(duì)微生物相互作用的理解。

 海螺溝冰川時(shí)間序列形成的生境為研究微生物演替的多樣性和軌跡提供了一個(gè)理想的自然場(chǎng)所，因?yàn)檫B續(xù)的演替階段允許通過替代時(shí)間的空間進(jìn)行詳細(xì)檢查。我們以前的研究表明，細(xì)菌群落受確定性過程的影響，而真菌群落則受沿冰川前場(chǎng)時(shí)間序列的隨機(jī)過程介導(dǎo)。在本研究中，我們的目的是利用現(xiàn)有的高通量測(cè)序數(shù)據(jù)集，深入研究豐富和稀有的微生物群落，以及沿冰川前場(chǎng)時(shí)間序列與生物和非生物因素相關(guān)的演替軌跡和群落聚集機(jī)制。具體地說，我們假設(shè)：（1）豐富的和稀有的類群之間存在著明顯的演替和組合模式，它們對(duì)群落變遷的相對(duì)貢獻(xiàn)隨時(shí)間序列的土壤發(fā)展而變得更加不均勻；（2）與稀有類群相比，豐富的類群關(guān)系更密切，對(duì)群落中其他共生物種的影響也更大，由于樹種和土壤養(yǎng)分含量的增加，它們之間的相互作用在演替中期階段得到加強(qiáng)；（3）在冰川消退的演替階段，稀有和豐富類群裝配的驅(qū)動(dòng)力是不同的。綜上所述，這項(xiàng)研究使我們能夠獨(dú)特地描述豐富和稀有類群的亞群落在一級(jí)演替期間如何在局部范圍內(nèi)發(fā)生變化，研究結(jié)果對(duì)未來全球變化下生態(tài)系統(tǒng)發(fā)展中的生態(tài)機(jī)制和微生物相互作用提供了新的認(rèn)識(shí)。

研究方法：

采樣對(duì)象

海螺溝冰川是位于青藏高原東南緣貢嘎山的季風(fēng)性溫帶冰川。2015年8月，在海螺溝冰川年代序列中，從7個(gè)地點(diǎn)（代表冰消期后的不同時(shí)間：3、12、30、40、52、80和120歲）采集了土壤樣本，這些地點(diǎn)經(jīng)歷了從裸露土壤到開荒群落，最終達(dá)到植被群落的最高峰。根據(jù)樹木年輪和土壤侵蝕速率，采用137 CS法對(duì)各階段的大致年齡進(jìn)行了校正。在每個(gè)試驗(yàn)節(jié)點(diǎn)，建立了3個(gè)5×5平方米的試驗(yàn)區(qū)，試驗(yàn)區(qū)之間的距離為10米。用一個(gè)直徑為5厘米的土壤取樣器從每塊地中心和4個(gè)角落采集5個(gè)20 cm深的土芯，五份土壤混成一份樣本，通過2mm篩除去根。

微生物分析

16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序（V4-V5）

研究結(jié)果：

豐富和稀有細(xì)菌類群的微生物動(dòng)態(tài)變化及系統(tǒng)發(fā)育多樣性

經(jīng)過質(zhì)量過濾和去除嵌合體后，擴(kuò)增子測(cè)序產(chǎn)生1,282,898個(gè)高質(zhì)量序列（每個(gè)樣本44455–80714個(gè)），這些序列聚集成5584個(gè)OTU（每個(gè)樣本2432±380個(gè)）。在整個(gè)數(shù)據(jù)集中，稀有類群包含1043個(gè)OTU，每個(gè)樣本平均占總OTU的25.1%，但只占有0.4%的序列。只有6.7%的OTU屬于豐富的微生物群，而它們占每個(gè)樣本中的大部分序列（平均63.7%）。與豐富的類群相比，稀有的類群顯示出更高的α-多樣性（例如，OTU豐富度和香農(nóng)指數(shù)）。

將一個(gè)樣本中稀有或豐富的類群的占比轉(zhuǎn)化成豐富、中等、稀有或未檢測(cè)出，從而可視化了土壤樣本中稀有和豐富類群的分布（圖1）。在局部豐富的OTU中（圖1a、b），32.25%的OTU在樣本間也很豐富，而10.50%的OTU在其它樣本中很稀有。在局部稀有的OTU中（圖1c，d），52.38%的OTUs在其它地方未檢測(cè)到，19.26%為中等豐度，幾乎沒有OTUs在其它樣本中是豐富的。

 

圖1海螺溝冰川時(shí)間序列中豐富和稀有菌的分布。面積圖顯示了一個(gè)樣本中豐富（A，B）或稀有類群（C，D）的百分比變化。

 

豐富和罕見的亞群落成分之間存在差異：Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Sphingobacteria, Acidobacteria_Gp6, Acidobacteria_Gp3, Acidobacteria_Gp2, Acidobacteria_Gp1, Acidobacteria_Gp4是最豐富的類群，Gammaproteobacteria, Deltaproteobacteria, Planctomycetia, Cytophagia, Chlamydia是最稀有的類群。微生物群落在時(shí)間序列上具有系統(tǒng)學(xué)上的不同（圖2）。整個(gè)群落和豐富細(xì)菌的NRI（凈種間親緣關(guān)系指數(shù)）值隨著土壤年齡的增長(zhǎng)而增加，而NTI（凈最近種間親緣關(guān)系指數(shù)）值則下降（圖2a-e）。然而，對(duì)于稀有細(xì)菌來說，隨著土壤年齡的增長(zhǎng)，NTI和NRI都顯著降低（圖2c，f）。

 

圖2 海螺溝冰川時(shí)間序列各階段（年齡）整體群落，豐富群落和稀有群落凈種間親緣關(guān)系指數(shù)（NRI）（A-C）和凈最近種間親緣關(guān)系指數(shù)（NTI）（D-F）的回歸分析

不同亞群的共現(xiàn)模式與拓?fù)湫再|(zhì)

元群落共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)在3728個(gè)OTU（節(jié)點(diǎn)）中捕獲了293352個(gè)關(guān)聯(lián)（邊緣）（圖3a）。此外，361個(gè)節(jié)點(diǎn)和218個(gè)節(jié)點(diǎn)分別屬于豐富類群和稀有類群。與稀有類群（82個(gè)內(nèi)部關(guān)聯(lián)）相比，豐富類群（111014）和中間豐富類群（117110）的內(nèi)部關(guān)聯(lián)更為復(fù)雜。對(duì)于外部關(guān)聯(lián)，我們觀察到豐富類群和中間豐富類群節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)數(shù)量最多（63411），稀有類群和豐富類群節(jié)點(diǎn)之間的關(guān)聯(lián)數(shù)量最少（23）。這些觀察表明，中間類群經(jīng)常與豐富類群共存，而稀有類群很少與豐富類群共存。在核心分類群和其他分類群的網(wǎng)絡(luò)中（圖3b），分別有8126和131664個(gè)內(nèi)部關(guān)聯(lián)，核心類群和其他類群之間有53562個(gè)外部聯(lián)系（圖3b）。此外，四個(gè)拓?fù)涮卣鳎ǘ?、中間性、緊密性和特征向量中心性）的值，對(duì)于豐富類群比稀有類群更高，對(duì)于核心類群也比其他類群更高。在不同的演替階段生成微生物共現(xiàn)網(wǎng)絡(luò)，計(jì)算網(wǎng)絡(luò)拓?fù)涮卣?，探討微生物?duì)土壤發(fā)育的響應(yīng)。在時(shí)間序列的中間階段，網(wǎng)絡(luò)變得最為聚集和復(fù)雜，其節(jié)點(diǎn)、邊緣關(guān)聯(lián)和內(nèi)部和外部關(guān)聯(lián)的數(shù)量最多。

 

圖3 基于相關(guān)分析的海螺溝冰川時(shí)間序列中豐富稀有細(xì)菌共生網(wǎng)絡(luò)圖：由豐富或稀有的分類群（A）和核心或其他分類群（B）組成的共生網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)大小與OTU的相對(duì)豐度成正比，節(jié)點(diǎn)之間連接的厚度（即邊緣）與Spearman相關(guān)系數(shù)的值成正比。每個(gè)生物圈之間的內(nèi)部和外部關(guān)聯(lián)（黑色數(shù)字）顯示在每個(gè)圖的右下角，每個(gè)生物圈中節(jié)點(diǎn)號(hào)的顏色對(duì)應(yīng)于類別。

不同微生物亞群落的模塊結(jié)構(gòu)

根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)計(jì)算的模塊，我們發(fā)現(xiàn)整個(gè)群落以及豐富亞群、稀有亞群、核心亞群和中間亞群被清晰地分為31、13、9、20和21個(gè)主要模塊（表1）。與隨機(jī)網(wǎng)絡(luò)相比，經(jīng)驗(yàn)網(wǎng)絡(luò)具有更高的avgCC、平均GD和模塊化值（表1），此外，與稀有亞群子網(wǎng)（分別為0.09和4.49）相比，豐富亞群子網(wǎng)具有更高的avgCC（0.14）和平均連通性（6.64），這意味著稀有亞群子網(wǎng)比豐富亞群子網(wǎng)更分散，連接更少（表1）。此外，模塊中心和連接分布在各種微生物類群中，我們?cè)谒屑?xì)菌的網(wǎng)絡(luò)中檢測(cè)到11個(gè)模塊中心，其中3個(gè)與Acidobacteria有關(guān)，1個(gè)與Alphaproteobacteria有關(guān)，3個(gè)與Bacteroidetes有關(guān)，而其它的則屬于Alphaproteobacteria, Betaproteobacteria, Planctomycetia, Actinobacteria, Omnitrophica。此外，我們還檢測(cè)到四個(gè)連接，分別屬于Chloroflexi, Gemmatimonadetes, Proteobacteria, Actinobacteria。

表1冰川時(shí)間序列上整個(gè)群落以及豐富亞群、稀有亞群、核心亞群和中間亞群的經(jīng)驗(yàn)分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)及其相關(guān)隨機(jī)分子生態(tài)網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)涮卣?/span>

 

此外，三元圖分析表明，大多數(shù)與Proteobacteria, Bacteroidetes, Acidobacteria相關(guān)的OTU在所有連續(xù)階段都很常見（圖4），Actinobacteria和 Gemmatimonadetes主要在早期和中期富集，而Planctomycetes和Verrucomicrobia則在晚期富集（圖4）。

 

圖4 三元圖顯示了三個(gè)連續(xù)階段（3-120年）的早期、中期和晚期所有OTU的相對(duì)豐度（>5‰）。每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)OTU。每個(gè)圓的大小代表它的相對(duì)豐度。它的位置代表了它相對(duì)于每個(gè)隔間的相對(duì)豐度。不同顏色的圓圈表示一個(gè)隔間內(nèi)顯著富集的OTU（例如，晚期為藍(lán)色，中期為橙色，早期為洋紅），而灰色圓圈表示在特定隔間內(nèi)沒有顯著富集的OTU。

豐富亞群與稀有亞群的反應(yīng)與驅(qū)動(dòng)力對(duì)比

五個(gè)亞群的β-多樣性在時(shí)間序列階段表現(xiàn)出明顯的不同反應(yīng)（圖5a）。稀有亞群的β-多樣性明顯高于其它四個(gè)亞群。豐富亞群和核心亞群的β-多樣性明顯低于整個(gè)群落（圖5a）。將微生物β-多樣性劃分為豐富度和更替（物種替換）組分表明，物種更替對(duì)β-多樣性的貢獻(xiàn)高于各亞群的物種豐富度（圖5b）。

 

圖5 基于Bray-Curtis（a），和物種更替以及豐富度的相對(duì)貢獻(xiàn)（b）進(jìn)行的海螺溝冰川年代不同細(xì)菌亞群β-多樣性分析

 

根據(jù)NMDS圖，將不同演替階段的細(xì)菌群落（包括所有物種群落、豐富物種和稀有物種）分為三個(gè)類群：S1作為類群1，S2-S5作為類群2，S6-S7作為類群3（圖6a-c）。與稀有亞群相比，豐富細(xì)菌亞群的格局更接近于整個(gè)細(xì)菌群落的格局。從不同演替階段的松散聚類和不同演替階段的群間距離比較可以看出，稀有類群與豐富類群及所有類群相比具有顯著的分散性（圖6c、f），這些觀察結(jié)果得到了稀有亞群和豐富亞群RDA結(jié)果的證實(shí)，表明細(xì)菌群落按演替階段強(qiáng)烈聚集。

 

圖6 海螺溝冰川時(shí)間序列細(xì)菌群落比較。 基于Bray-Curtis距離（A-C）的細(xì)菌群落非度量多維標(biāo)度（NMDS）排序。不同演替階段（d-f）土壤微生物群落的Bray-Curtis差異分析。

 

此外，前兩個(gè)RDA組成部分解釋的總變化，對(duì)于豐富亞群（73.9%）要比稀有亞群（19.43%）高得多（圖7a，b）。變異分配分析表明，生物和土壤因子的相互作用比土壤和生物因子單獨(dú)在確定豐富和稀有亞群組成中更為重要（圖7c，d）。此外，掃描電鏡模型顯示，土壤年齡、土壤酸堿度、土壤有機(jī)碳和植物豐富度是豐富類群多樣性的重要因素，而土壤年齡、土壤酸堿度、總氮和土壤有機(jī)碳是稀有類群多樣性的重要因素（圖7e、f）。

 

圖7海螺溝冰川時(shí)間序列上豐富和稀有亞群結(jié)構(gòu)的所選環(huán)境變量的冗余縱坐標(biāo)（a，b）、變異分配分析（c，d）和結(jié)構(gòu)方程建模（e，f）。