天昊微生物項(xiàng)目文章：黑果枸杞花青素對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的調(diào)控及抗炎作用

發(fā)稿時(shí)間：2019-08-15來源：天昊生物

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院近期在《Free Radical Biology and Medicine》上發(fā)表了黑果枸杞花青素對(duì)右旋糖酐硫酸鈉導(dǎo)致的結(jié)腸炎小鼠腸道菌群的調(diào)控及抗炎作用的文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的相對(duì)定量擴(kuò)增子測(cè)序和生信分析工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：Gut microbiota modulation and anti-inflammatory properties of anthocyanins from the

fruits of Lycium ruthenicum Murray in dextran sodium sulfate-induced colitis in mice

中文題目：黑果枸杞花青素對(duì)右旋糖酐硫酸鈉導(dǎo)致的結(jié)腸炎小鼠的腸道菌群調(diào)控及抗炎作用

期刊名：Free Radical Biology and Medicine

影響因子： 5.657

發(fā)表時(shí)間： 2019年 

研究概要：

研究了黑枸杞果實(shí)粗花青素（ACN）和ACN主單體（P3G）對(duì)右旋糖酐硫酸鈉（DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎的治療作用?；ㄇ嗨兀?/span>ACN）和P3G均表現(xiàn)出腸道抗炎作用，主要表現(xiàn)在可以恢復(fù)各種體征（體重、飼料量、糞便固體重量和結(jié)腸長(zhǎng)度增加，DAI評(píng)分降低）、減少促炎細(xì)胞因子和相關(guān)mRNA（如TNF-α，IL-6, IL-1β ， IFN-γ）表達(dá)以及通過組織學(xué)和免疫熒光證明促進(jìn)腸道屏障功能（蛋白質(zhì)如ZO-1，occludin，claudin-1增加）。此外，還研究了DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎對(duì)腸道微生物群的影響，發(fā)現(xiàn)Porphyromonadaceae, Helicobacter, Parasutterella, Parabacteroides, Oscillibacter, Lachnospiraceae是炎癥性腸病的主要病原菌?？傊?，P3G和ACN通過阻斷促炎細(xì)胞因子、增加緊密連接蛋白和調(diào)節(jié)腸道微生物群三個(gè)方面改善了DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎，而且，P3G比ACN具有更好的抗炎作用。

研究背景：

潰瘍性結(jié)腸炎（UC）和克羅恩?。?/span>CD）是炎癥性腸病（IBD）的兩種主要形式，在過去幾十年中已成為西方世界主要的胃腸道疾病之一。CD影響從口腔到肛門的整個(gè)消化道，而UC主要影響結(jié)腸和直腸，因此可以將他們通過組織學(xué)外觀區(qū)分開來。CD和UC是慢性炎癥性疾病，在醫(yī)學(xué)上無法治愈。目前最常見的治療IBD的藥物，如氨基水楊酸鹽和免疫調(diào)節(jié)劑，已顯示出嚴(yán)重的副作用，如影響腎功能。因此，越來越多的人需要從天然和功能性食品中提取替代品用于IBD治療，如多酚、萜類和生物堿。

近二十年來，多酚物質(zhì)一直是預(yù)防和治療慢性病的重點(diǎn)，由于具有良好的抗炎、抗氧化、胰島素敏感性作用和降低心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的能力，它們被公認(rèn)為促進(jìn)健康的植物化學(xué)物質(zhì)。其中白藜蘆醇、姜黃素、槲皮素和花青素是最常見的多酚類物質(zhì)，其對(duì)IBD的治療作用已在動(dòng)物模型中得到驗(yàn)證，其治療IBD的靶點(diǎn)通常包括核因子κB (NF-κB)途徑和腸屏障功能的調(diào)節(jié)，但越來越多的研究表明腸道微生物群是一個(gè)重要靶點(diǎn)。腸道微生物群和特定的微生物群與免疫、營(yíng)養(yǎng)、代謝等多種生理功能和健康狀況密切相關(guān)。一方面，腸道微生物群對(duì)多酚物質(zhì)的代謝可以提高多酚的生物利用度和生物活性。另一方面，多酚物質(zhì)的代謝產(chǎn)物可以調(diào)節(jié)腸道微生物群的結(jié)構(gòu)，從而影響腸道微生物群的代謝途徑和代謝產(chǎn)物。因此，闡明這些指標(biāo)之間的關(guān)系，找出關(guān)鍵的腸道微生物群是至關(guān)重要的。

枸杞是茄科枸杞屬植物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。它營(yíng)養(yǎng)豐富，尤其是花青素，具有多種生物活性?；ㄇ嗨厥且活悘V泛存在于植物中的黃酮類化合物，是可溶性天然色素。它們具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗菌、神經(jīng)保護(hù)和視力保護(hù)活性。我們以前的研究結(jié)果表明，從黑果枸杞中提取的花青素（ACN）可以促進(jìn)腸道微生物群中雙歧桿菌的生長(zhǎng)，降低厚壁菌與擬桿菌的比例，增加短鏈脂肪酸的產(chǎn)生，從而有利于促進(jìn)腸道微生物群的生長(zhǎng)，從而對(duì)人體腸道微生物群有有益的調(diào)節(jié)作用。P3G，作為黑果枸杞中的主要單體，具有很強(qiáng)的抗氧化活性。據(jù)報(bào)道，藍(lán)莓、黑樹莓、紫胡蘿卜和黑米中的花青素對(duì)小鼠IBD有較好的緩解作用。此外，黑樹莓的花青素還可以逆轉(zhuǎn)右旋糖酐硫酸鈉（DSS）引起的腸道微生物群失衡，如脫硫弧菌和腸球菌的相對(duì)豐度增加，直腸真桿菌、普氏糞桿菌、乳酸桿菌相對(duì)豐度降低。在研究中，采用了花青素（ACN）粗提物，然而，關(guān)于花青素單體對(duì)IBD影響的信息很少。因此，本研究采用DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎模型，研究了黑果枸杞中的花青素（ACN）及其主要單體P3G的腸道抗炎作用，并對(duì)它們的抗炎作用進(jìn)行了比較。

研究方法：

動(dòng)物處理

5周齡雄性C57BL/6小鼠在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室條件下飼養(yǎng)：25±2℃，50±5%濕度，12 h/12 h光/暗循環(huán)。40只小鼠平均分為4組（NC、DSS、P3G-DSS和ACN-DSS）。DSS組、P3G-DSS組和ACN-DSS組在第1-8天的飲水中給予1.5%的DSS，而NC組給予無DSS的飲水。9-16天，在P3G-DSS和ACN-DSS組中給小鼠P3G（200 mg/kg/d）或ACN200 mg/kg/d），NC和DSS組則給小鼠飲用水。實(shí)驗(yàn)期間，每天測(cè)量體重、糞便固體重量和食物消耗量。結(jié)合（i）體重減輕分?jǐn)?shù)（0: none, 1: 1-5%, 2: 5-10%, 3: 10-20%, 4: ＞20%）；(ii)腹瀉分?jǐn)?shù)（0:正常，1和2:大便松動(dòng)，3和4:腹瀉）；（iii）血液分?jǐn)?shù)（0:正常，1:+，2:++，3:++ +，4: ++++）來獲得評(píng)價(jià)IBD嚴(yán)重程度的疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）。體重下降的計(jì)算方法為原始體重（第0天）與任何特定日期體重之間的百分比差異。第17天處死小鼠，收集所有動(dòng)物的結(jié)腸組織、血清和糞便樣品。將血清、盲腸內(nèi)容物和結(jié)腸的一半保存在80℃下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，另一半結(jié)腸固定在4%緩沖甲醛中進(jìn)行組織學(xué)觀察。

血清細(xì)胞因子測(cè)定

應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒測(cè)定了腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、干擾素γ（IFN-γ）和單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP-1）的含量。用商業(yè)試劑盒測(cè)定血清中脂多糖（LPS）和前列腺素E 2（PGE 2）的含量。

組織學(xué)評(píng)價(jià)

石蠟包埋結(jié)腸組織切片，蘇木精和伊紅染色。所有組織切片均采用盲法評(píng)估。根據(jù)炎癥浸潤(rùn)程度（0-5）、隱窩損傷（0-4）、潰瘍（0-3）和是否有水腫（0或1）對(duì)這些切片進(jìn)行評(píng)分。

免疫熒光評(píng)價(jià)

在-20℃甲醇或丙酮中固定和滲透后，將結(jié)腸組織與一級(jí)抗體在4℃孵育過夜，然后在室溫下與FITC標(biāo)記的二級(jí)抗體孵育1h。然后用DAPI進(jìn)行核復(fù)染。熒光顯微鏡觀察圖像，在組織切片的同一區(qū)域采集DAPI和FITC圖像。

基因表達(dá)定量分析

提取結(jié)腸標(biāo)本總RNA，并使用Nanodrop 2000分光光度計(jì)進(jìn)行定量。cDNA合成后，使用GAPDH作為內(nèi)參基因進(jìn)行RT-qPCR。

短鏈脂肪酸含量測(cè)定

用氣相色譜法（GC）標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定盲腸內(nèi)容物、糞便和血清中的乙酸、丙酸、正丁酯、異丁酸、N-戊酸和異戊酸等SCFA含量。在GC分析之前，通過旋渦和離心將適當(dāng)量的盲腸內(nèi)容物或糞便與5倍體積的水混合，并將所得上清液與等量的2-乙基丁酸（內(nèi)標(biāo)）混合。按報(bào)告方法進(jìn)行血清處理，并按報(bào)告方法進(jìn)行氣相色譜分析。根據(jù)說明書用乳酸測(cè)定試劑盒測(cè)定乳酸含量。

微生物群落分析

采集小鼠糞便，經(jīng)液氮冷凍后，置于-80℃保存。用QIAamp? Fast DNA Stool Mini Kit糞便試劑盒提取小鼠糞便中總細(xì)菌DNA。然后進(jìn)行16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序（V4）。

研究結(jié)果：

花青素對(duì)DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的作用明顯

體重、飼料量、疾病活動(dòng)指數(shù)（DAI）評(píng)分、糞便固體重量和結(jié)腸長(zhǎng)度的變化如圖2所示。經(jīng)DSS處理后，體重、飼料量、糞便固形物量均明顯下降。同時(shí)，DAI得分迅速上升。DSS停藥后，體重、飼料量、糞便固體量逐漸恢復(fù)，DAI評(píng)分同時(shí)下降。第16天，P3G-DSS組體重與NC組基本相同（P>0.05），但明顯高于ACN-DSS組和DSS組（P<0.05）。NC組、P3G-DSS組和ACN-DSS組的飼料量均高于DSS組（P＜0.05）。然而，四組之間的固體糞便重量沒有顯著差異。四組的DAI評(píng)分和結(jié)腸長(zhǎng)度有顯著差異：NC組結(jié)腸長(zhǎng)度最長(zhǎng)，P3G-DSS組次之，ACN-DSS組次之，DSS組次之，DAI評(píng)分結(jié)果正好相反。

 

圖2.（a）體重；（b）飼料量；（c）固體糞便重量；（d）DAI評(píng)分；（e）結(jié)腸長(zhǎng)度；（f）結(jié)腸長(zhǎng)度照片（每組一個(gè)代表性結(jié)腸）。

花色苷對(duì)血清促炎細(xì)胞因子的影響

血清中促炎性細(xì)胞因子的含量如圖3所示。與NC組相比，DSS組所有促炎細(xì)胞因子均顯著升高（P<0.05）。經(jīng)P3G和ACN治療后，促炎細(xì)胞因子水平接近NC組，低于DSS組（P<0.05）。一般情況下，黑果枸杞花色苷能抑制DSS誘導(dǎo)的血清促炎性細(xì)胞因子水平。

 

圖3.P3G和ACN對(duì)血清炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響（a）TNF-α；（b）IL-1β；（c）IL-6；（d）IFN-γ；（e）LPS；（f）MCP-1；（g）PGE 2

組織學(xué)特征

H&E染色組織切片和組織病理學(xué)評(píng)分如圖4a所示。NC組結(jié)腸病理形態(tài)正常，無炎癥反應(yīng)和損傷。DSS處理小鼠結(jié)腸出現(xiàn)嚴(yán)重急性結(jié)腸炎，表現(xiàn)為杯狀細(xì)胞和淺表上皮細(xì)胞消失，粘膜和粘膜下層大面積單核白細(xì)胞炎性浸潤(rùn)，腸黏膜與肌層間有水腫。兩組花色素苷治療小鼠的病理?yè)p傷均顯著降低。P3G-DSS組有輕微炎癥反應(yīng)，杯狀細(xì)胞基本恢復(fù)正常，水腫明顯改善，無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。ACN-DSS組中度炎癥，杯狀細(xì)胞損傷1/2，水腫改善不明顯，與P3G-DSS組比較，仍有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。根據(jù)結(jié)腸炎評(píng)分，P3G和ACN均能改善炎癥程度（P<0.05），P3G效果較好。

 

圖4. a.蘇木精、伊紅染色結(jié)腸組織切片顯微鏡顯示：（a）NC組；（b）DSS組；（c）P3G-DSS組；（d）ACN-DSS組；（e）各組結(jié)腸炎評(píng)分。b.4組claudin-1、occludin和zo-1免疫熒光的圖像。緊密連接蛋白染色為綠色，核染色為藍(lán)色。用Image Pro Plus 6.0軟件分析這些蛋白質(zhì)的平均密度。

免疫熒光特性

zonula occludens-1 (ZO-1)，occludin， caludin-1的免疫熒光分析結(jié)果如圖4b所示。與NC組相比，DSS治療導(dǎo)致了三種蛋白含量的顯著降低。與DSS組相比，P3G和ACN處理的小鼠這些蛋白質(zhì)的含量增加。結(jié)果表明，花青素在蛋白質(zhì)水平上促進(jìn)腸屏障功能。

花青素對(duì)炎癥和腸道完整性相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)的調(diào)控

圖5顯示了P3G和ACN對(duì)參與結(jié)腸炎癥和結(jié)腸腸道完整性相關(guān)基因表達(dá)的影響。與DSS組相比，花青素顯著抑制了誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）、環(huán)氧合酶-2（COX-2）、TNF-α、IL-6、IL-1β、IFN-γ、MCP-1、Toll樣受體4（TLR-4）、Nod樣受體蛋白3（NLRP3）的表達(dá)（P＜0.05），促進(jìn)了ZO-1、occludin、 caludin-1、游離脂肪酸受體2（FFAR2）和游離脂肪酸受體3（FFAR3）?？偟膩碚f，黑色素果實(shí)中的花青素可以調(diào)節(jié)這些基因的表達(dá)，接近NC組水平。另外P3G在COX-2、TNF-α、IFN-γ、 FFAR2的表達(dá)上比ACN有更好的調(diào)節(jié)能力。

 

圖5.P3G或ACN對(duì)結(jié)腸中mRNA相對(duì)表達(dá)的影響。(A) iNOS; (B) COX-2; (C) TNF-α; (D) IL-6; (E) IL-1β; (F) IFN-γ; (G) MCP-1; (H) TLR-4; (I) NLRP-3; (J) ZO-1; (K) Occludin; (L) Caludin-1; (M) FFAR2; (N) FFAR3。

花青素對(duì)短鏈脂肪酸的影響

不同組別SCFAs的變化如圖6所示。DSS組盲腸內(nèi)容物和糞便中乙酸、丙酸、異丁酸和總酸含量顯著降低（P＜0.05），但血清中的含量變化不明顯（P＜0.05）。經(jīng)P3G和ACN處理后，盲腸和糞便中乙酸、丙酸、異丁酸和總酸的含量明顯高于DSS組（P<0.05）。與DSS組相比，經(jīng)P3G和ACN處理后血清無顯著性差異。值得注意的是，血清中乳酸含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他酸，血清乳酸含量各組間無顯著性差異。

 

 

 

圖6.P3G或ACN對(duì)SCFAs（A、盲腸內(nèi)容物、B、糞便、C、血清）的影響。

花青素和DSS對(duì)腸道微生物群的影響

每個(gè)樣本的稀疏曲線和Shannon-Wiener曲線趨于平坦，表明測(cè)序深度足夠，測(cè)序結(jié)果可信。圖7a顯示了代表所有組α多樣性的香農(nóng)指數(shù)。P3G-DSS和ACN-DSS組與NC組幾乎相同（p>0.05）。相比之下，DSS組的多樣性明顯低于NC組（P<0.05）。圖7b顯示了以主成分分析（PCA）為代表的β多樣性，表明DSS顯著改變了腸道微生物群，在此基礎(chǔ)上，P3G和ACN可以調(diào)節(jié)腸道微生物群。在門水平的細(xì)菌組成方面（圖7c），與NC組相比，DSS處理降低了Bacteroidetes的相對(duì)豐度，增加了Firmicutes的相對(duì)豐度，但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖7d和7e）。P3G-DSS組與DSS組趨勢(shì)相反，與NC組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果表明，P3G-DSS組Firmicutes/Bacteroidetes的比例顯著低于NC或DSS組（圖7g）。此外，ACN-DSS組Actinobacteria相對(duì)豐度最高（圖7f）。

 

 

圖7. P3G或ACN調(diào)節(jié)DSS處理誘導(dǎo)的腸道微生物群組成。（a）Shannon指數(shù)獲得的α多樣性比較；（b）腸道微生物群PCA分析；（c）門水平微生物組成柱狀圖；（d）Bacteroidetes類桿菌的相對(duì)豐度；（e）Firmicutes厚壁菌的相對(duì)豐度；（f）Actinobacteria放線菌的相對(duì)豐度。（g）類桿菌與擬桿菌的比值。

 

DSS處理后，Porphyromonadaceae、Rikenellaceae、Prevotellaceae的相對(duì)豐度顯著降低，而Bacteroidaceae、 Verrucomicrobiaceae、Sutterellaceae的相對(duì)豐度顯著高于NC組。然而，花青素能逆轉(zhuǎn)DSS誘導(dǎo)的Porphyromonadaceae、Rikenellaceae、Prevotellaceae相對(duì)豐度的下降。但花青素對(duì)DSS增加的Bacteroidaceae、 Verrucomicrobiaceae、Sutterellaceae相對(duì)豐度無顯著影響。

為了明確哪種細(xì)菌可能對(duì)IBD產(chǎn)生影響，采用LEfSe對(duì)相對(duì)豐度大于0.5%的OTU進(jìn)行分析，得到各群體的優(yōu)勢(shì)OTUs，結(jié)果顯示，4組中85個(gè)占優(yōu)勢(shì)的OTU使用heatmap熱圖一起顯示（圖8a）：值得注意的是，屬于Lactobacillus乳酸桿菌屬的OTU 168和OTU 084是P3G-DSS組的優(yōu)勢(shì)OUT，結(jié)果也顯示在LEfSe分析結(jié)果中，共有15個(gè)不同的OTU被花青素干預(yù)顯著逆轉(zhuǎn)。

通過Spearman相關(guān)分析分析了15個(gè)不同的OTU和IBD參數(shù)之間的相關(guān)性（圖8b），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這15個(gè)OTU與IBD的一個(gè)參數(shù)至少呈負(fù)相關(guān)或正相關(guān)，包括體重、DAI評(píng)分、血清中炎性因子、腸長(zhǎng)度、炎癥和腸完整性相關(guān)基因在腸組織中的表達(dá)。其中，OTU441、OTU334、OTU604和OTU523與促進(jìn)IBD的參數(shù)呈負(fù)相關(guān)，與預(yù)防IBD的參數(shù)呈正相關(guān)，其它11個(gè)OTU恰恰相反。

 

 

圖8.a. LEfSe分析DSS、P3G或ACN改變的腸道微生物群組成。（a）線性判別分析（LDA）；（b）根據(jù)不同組85個(gè)OTU的相對(duì)豐度得到的heatmap圖；（c）DSS或花青素干預(yù)引起的OTU的變化方向；（d）OTU代表細(xì)菌分類信息（門、科、屬和種），利用Tukey’s HSD檢驗(yàn)計(jì)算OTU相對(duì)豐度的差異；b.用Spearman分析花青素干預(yù)逆轉(zhuǎn)的15個(gè)OTU與IBD參數(shù)的相關(guān)性。（a）heatmap顯示相關(guān)系數(shù)的值。*和**表示有意義的關(guān)聯(lián)（分別為p<0.05和p<0.01）；（b）OTU表示細(xì)菌分類信息（門、科、屬和種）。

 

除分類組成外，圖9顯示了PICRUSt預(yù)測(cè)的不同組之間的功能差異?？梢钥闯?，功能的變化更多地依賴于P3G而非ACN。與DSS組的比較顯示，經(jīng)P3G和ACN處理后，30個(gè)（22個(gè)富集，8個(gè)減少）和7個(gè)（3個(gè)富集，4個(gè)減少）功能模塊分別顯著改變（p<0.05）。ACN的處理主要引起一些代謝途徑的變化，如其它次生代謝產(chǎn)物的生物合成、能量代謝和異種生物降解代謝等。P3G的治療導(dǎo)致更復(fù)雜的功能途徑發(fā)生變化，主要是代謝、組織系統(tǒng)和人類疾病的途徑，如轉(zhuǎn)錄因子、檸檬酸循環(huán)（TCA循環(huán)）、氧化磷酸化、卟啉和葉綠素代謝。這說明花青素的干預(yù)有助于導(dǎo)致腸道微生物群的功能差異。

 

圖9. PICRUSt預(yù)測(cè)的花青素對(duì)微生物群落功能的影響。

研究總結(jié)：

• 黑果枸杞花青素對(duì)DSS誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎具有抗炎作用。
•  黑果枸杞花青素下調(diào)炎癥相關(guān)細(xì)胞因子來應(yīng)對(duì)IBD的反應(yīng)。
• 黑果枸杞花青素上調(diào)緊密連接蛋白應(yīng)來對(duì)IBD的反應(yīng)。
• 黑果枸杞花青素能調(diào)節(jié)腸道微生物群，提高SCFA的產(chǎn)量。