單細(xì)胞RNA-seq揭示胰腺癌瘤內(nèi)異質(zhì)性及惡性進(jìn)展

發(fā)稿時(shí)間：2019-07-31來源：天昊生物

 

文章標(biāo)題：Single-cell RNA-seq highlights intra-tumoral heterogeneity and malignant progression in pancreatic ductal adenocarcinoma

期刊雜志：Cell Research (IF: 17.848)

發(fā)表時(shí)間：2019年7月4日

研究單位：北京協(xié)和醫(yī)院、中國科學(xué)院北京基因組研究所等

 

研究背景

基因組和轉(zhuǎn)錄組研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些關(guān)鍵的基因突變或異常的信號(hào)通路驅(qū)動(dòng)著胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）的發(fā)病，如KRAS、TP53、SMAD4，TGF-β、Notch信號(hào)通路等，然而這些發(fā)現(xiàn)還并未有臨床轉(zhuǎn)化。同時(shí)PDAC細(xì)胞間存在瘤內(nèi)異質(zhì)性，因此基于細(xì)胞群的mRNA測(cè)序去發(fā)現(xiàn)遺傳變異變得更具有挑戰(zhàn)性，利用細(xì)胞群分析瘤內(nèi)異質(zhì)性的技術(shù)限制也阻礙了發(fā)現(xiàn)切實(shí)可行的診斷標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。近來單細(xì)胞基因組和單細(xì)胞RNA測(cè)序技術(shù)為揭示遺傳和功能異質(zhì)性、細(xì)胞亞群、進(jìn)化譜系重建、腫瘤相關(guān)機(jī)制等提供了重要的工具。

 

主要研究思路及方法

24例原發(fā)性PDAC腫瘤樣本 vs 11例對(duì)照胰腺樣本

57,530個(gè)細(xì)胞（41,986 cells from PDAC and 15,544 cells from control pancreases）

10x Genomics 3’單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

 

 

主要研究結(jié)果

1. Single-cell expression atlas and cell typing in PDAC tumors and control samples（單細(xì)胞表達(dá)圖譜）

來源于24例PDAC腫瘤樣本和11例對(duì)照胰腺樣本的共計(jì)57,530個(gè)細(xì)胞圖譜，主成分分析能夠發(fā)現(xiàn)10種主要的細(xì)胞類別，包括1型導(dǎo)管細(xì)胞、2型導(dǎo)管細(xì)胞、腺泡細(xì)胞、內(nèi)分泌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、星形細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞和B細(xì)胞。

 

不同的cluster具有特定的marker基因，細(xì)胞特定的marker可以用來識(shí)別細(xì)胞類型，如導(dǎo)管細(xì)胞中的KRT19，腺泡細(xì)胞中的PRSS1等。

 

2. CNV landscape distinguishing malignant ductal cells in PDACs（CNV數(shù)據(jù)區(qū)分細(xì)胞）

為了鑒別惡性的細(xì)胞，基于平均的表達(dá)模式可以計(jì)算大規(guī)模的染色體拷貝數(shù)變異（CNV）。其中2型導(dǎo)管細(xì)胞比1型導(dǎo)管細(xì)胞和其它細(xì)胞具有顯著更高的CNV水平。

 

對(duì)兩種類型的導(dǎo)管細(xì)胞表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)3107差異表達(dá)的基因，功能富集分析顯示2型細(xì)胞中上調(diào)的基因主要富集在癌癥相關(guān)的功能，如細(xì)胞增殖、遷移和缺氧，進(jìn)一步驗(yàn)證了這種亞型的惡性狀態(tài)。1型細(xì)胞中上調(diào)的基因與正常的胰腺功能相關(guān)，包括消化、胰腺分泌和碳酸氫鹽運(yùn)輸，表明1型細(xì)胞仍然具有一定程度的導(dǎo)管細(xì)胞的正常功能。利用免疫組化染相應(yīng)的marker也能驗(yàn)證兩種導(dǎo)管細(xì)胞的存在，也驗(yàn)證了2型細(xì)胞是PDAC惡性細(xì)胞的主要來源。

 

到底哪種胰腺細(xì)胞類型負(fù)責(zé)腫瘤的起始仍不得而知，對(duì)異常的1型細(xì)胞和惡性的2型細(xì)胞基因表達(dá)特征進(jìn)行擬時(shí)分析（腺泡細(xì)胞太少，無法進(jìn)一步分析過渡狀態(tài)）。對(duì)PDAC進(jìn)展軌跡中的所有基因表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)2299個(gè)基因具有動(dòng)態(tài)的變化，將這些基因分成4種異常的表達(dá)模式（P1-P4）和4種惡性的表達(dá)模式（P5-P8），多種關(guān)鍵的調(diào)控因子和轉(zhuǎn)錄因子被激活參與到PDAC的腫瘤形成過程。

 

3. Distinct subgroups in malignant ductal cells（惡性導(dǎo)管細(xì)胞中的不同亞群）

基于t-SNE分析將2型導(dǎo)管細(xì)胞進(jìn)一步分成7個(gè)亞群，對(duì)每個(gè)亞群進(jìn)行功能富集分析發(fā)現(xiàn)第七個(gè)亞群與細(xì)胞周期和細(xì)胞增殖的功能相關(guān)，其中增殖相關(guān)的marker有特定的表達(dá)，如MKI67、TOP2A、CCNB1和CCNB2。

 

4. Gene expression pattern analyses in TCGA PAAD samples based on malignant ductal markers（基于惡性的導(dǎo)管細(xì)胞marker分析TCGA樣本的基因表達(dá)特征）

利用惡性導(dǎo)管細(xì)胞marker對(duì)TCGA中178例胰腺癌樣本（146例PDAC，32例非PDAC）進(jìn)行聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)所有樣本可以分成3個(gè)PDAC的cluster及1個(gè)非PDAC的cluster。同時(shí)，增殖相關(guān)的marker與其它marker明顯被區(qū)分開，主要集中在cluster2和cluster3中。惡性導(dǎo)管細(xì)胞marker可以有效地區(qū)分PDAC患者和其它類型的胰腺癌患者。

 

然后利用增殖相關(guān)的marker分析其預(yù)后價(jià)值，發(fā)現(xiàn)根據(jù)表達(dá)水平能夠?qū)?/span>PDAC患者分成3個(gè)亞群，其中group3有顯著更高的增殖marker，而且其生存率顯著更低。利用特定的藥物靶向增殖相關(guān)的marker（CDK1、PLK1、AURKA），這些抑制劑能夠顯著地抑制細(xì)胞增殖。

 

再比較group3和其它兩組間的TCGA轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)759個(gè)上調(diào)的基因，946個(gè)下調(diào)的基因。功能富集分析顯示上調(diào)的基因富集在細(xì)胞周期、DNA復(fù)制和DNA修復(fù)，下調(diào)的基因富集在T細(xì)胞選擇、淋巴細(xì)胞激活上。

 

再將這些差異表達(dá)的基因在單細(xì)胞數(shù)據(jù)中分析其表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)很多上調(diào)的基因主要表達(dá)在2型導(dǎo)管細(xì)胞中，而下調(diào)的基因主要位于巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞中，表明異常的導(dǎo)管增殖和免疫反應(yīng)同時(shí)在腫瘤微環(huán)境中發(fā)生。

5. Inactivation of T cells in PDAC patients with high abundance of proliferative ductal markers（高豐度的增殖marker患者中T細(xì)胞失活）

為了評(píng)價(jià)PDAC中浸潤T細(xì)胞的功能，利用TCGA數(shù)據(jù)分析PDAC基質(zhì)中T細(xì)胞激活狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)增殖marker高表達(dá)的樣本中T細(xì)胞marker表達(dá)卻更低，單細(xì)胞測(cè)序數(shù)據(jù)中也能發(fā)現(xiàn)這種負(fù)相關(guān)的關(guān)系，同時(shí)利用免疫染色驗(yàn)證了這種關(guān)系。

 

總結(jié)討論

總體上這些結(jié)果為揭示PDAC中異質(zhì)性細(xì)胞的基因表達(dá)圖譜、PDAC瘤內(nèi)異質(zhì)性的機(jī)制提供了寶貴的資源，同時(shí)關(guān)鍵的信號(hào)通路可能調(diào)控瘤內(nèi)異質(zhì)性的發(fā)生及PDAC的腫瘤進(jìn)展。10x Genomics Chromium系統(tǒng)被評(píng)價(jià)為最優(yōu)化的商業(yè)平臺(tái)，包括其分子靈敏度、準(zhǔn)確性及最低的技術(shù)噪音等方面均優(yōu)于其它的高通量單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序平臺(tái)，如inDrop和Drop-seq。