祝賀！天昊生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)助力客戶登陸Science of the Total Environment

發(fā)稿時(shí)間：2019-07-01來源：天昊生物

 

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)陳巍課題組近期在《Science of the Total Environment》上發(fā)表了高通量微生物絕對定量測序揭示不同施肥應(yīng)用對種植番茄的濱海鹽漬土壤細(xì)菌群落的影響的文章。在這項(xiàng)研究中使用了天昊生物創(chuàng)新型的的微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序技術(shù)。在恭喜客戶發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：High-throughput absolute quantification sequencing reveals the effect of different fertilizer applications on bacterial community in a tomato cultivated coastal saline soil

中文題目：高通量微生物絕對定量測序揭示不同施肥應(yīng)用對種植番茄的濱海鹽漬土壤細(xì)菌群落的影響

期刊名：Science of the Total Environment    

影響因子： 5.589

研究概要：

濱海鹽漬土是一種重要的后備土地資源，具有很高的農(nóng)業(yè)利用潛力。本研究采用高通量微生物16S絕對定量方法，研究了4種不同施肥方式（100%生物有機(jī)肥、70%生物有機(jī)肥和30%化肥、30%生物有機(jī)肥和70%化肥、100%化學(xué)肥）對番茄鹽漬土壤細(xì)菌群落組成的影響。田間試驗(yàn)結(jié)果表明，70%生物有機(jī)肥加30%化肥是沿海灘涂地區(qū)發(fā)展番茄栽培（提高產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)）的最佳劑量。盆栽試驗(yàn)對番茄的生長也有類似的結(jié)果，同時(shí)表明70%生物有機(jī)肥加30%化學(xué)肥料對土壤微生物群的活化效果最好。肥料對土壤養(yǎng)分的輸入增加了細(xì)菌的總豐度（比初始土壤增加了3倍），同時(shí)導(dǎo)致土壤中細(xì)菌多樣性的顯著喪失。其中以變形桿菌、擬桿菌和厚壁菌為主的門是微生物群落轉(zhuǎn)變的主要原因，特別是在70%生物有機(jī)肥和100%化肥處理的土壤中，其富集程度顯著。RDA和皮爾遜相關(guān)分析表明，土壤養(yǎng)分，特別是有效磷、有效鉀和土壤鹽分是影響該生態(tài)系統(tǒng)細(xì)菌群落的主要環(huán)境因子，但有機(jī)質(zhì)含量和土壤酸堿度也在微生物群落的組裝中起著重要作用。

研究背景：

鹽漬土在世界范圍內(nèi)廣泛分布，占地球表面的8%。我國鹽漬土總面積為3.67×10⁷ha，其中30%具有農(nóng)業(yè)利用價(jià)值。濱海鹽漬土是鹽漬土的一個(gè)亞類，是江蘇省重要的潛在土地資源。中國沿?？偯娣e2.17×10⁶ha，其中95%為潮間帶，江蘇約占1/4。此外，由于黃河和長江的大量泥沙淤積，該地區(qū)的灘涂以每年50-200米的速度擴(kuò)張。因此，沿海鹽漬土（灘涂地區(qū)）被認(rèn)為是農(nóng)業(yè)發(fā)展的儲(chǔ)備地，具有很大的潛力，可以緩解我國土地資源不足的壓力。

然而，沿海灘涂地區(qū)由于其高鹽度，通過高滲透脅迫、營養(yǎng)缺乏、毒性和不良的物理土壤條件抑制了大部分作物，因此沿海灘涂地區(qū)通常具有植物生長不良和微生物活性低的特點(diǎn)。因此，除了培育耐鹽植物品種外，還需要可持續(xù)的生物技術(shù)來提高沿海鹽土的質(zhì)量，特別是那些通過植物根系和微生物群之間的互作來發(fā)揮作用的技術(shù)。為了提高土壤肥力和作物產(chǎn)量，人們嘗試了各種技術(shù)來改良沿海鹽漬土，包括化學(xué)、物理、生物和工程改良。例如，Liu等人（2015）發(fā)現(xiàn)，在牛糞、石膏和一種新的改良劑產(chǎn)品的應(yīng)用中，牛糞通過引入豐富的有機(jī)質(zhì)（OM），從而提高土壤微生物活性，在改善濱海鹽土性質(zhì)方面取得了富有希望的成果。此外，Chen等人（2016）的研究表明，施用富含真菌木霉菌的生物有機(jī)肥可使鹽地堿蓬的生長量增加83%，并顯著改變土壤微生物生物量。顯然，有機(jī)堆肥或生物功能性有機(jī)肥與不同比例的化肥的結(jié)合在這一領(lǐng)域受到越來越多的關(guān)注。在農(nóng)業(yè)中，富含有益微生物的有機(jī)生物肥與化肥的結(jié)合使用，是提高土壤肥力，增加土壤有機(jī)質(zhì)、孔隙、持水能力和微生物活性，同時(shí)減少化肥施用總量（可能導(dǎo)致沿海生態(tài)系統(tǒng)次生鹽堿化）的一種很有前景的途徑。

土壤微生物群落在調(diào)節(jié)植物耐鹽性和提高鹽漬土壤質(zhì)量中起著關(guān)鍵作用。然而，對于微生物群對鹽漬土中外源添加的反應(yīng)，尤其是在這種情況下細(xì)菌群落的裝配動(dòng)力學(xué)，人們知之甚少。在過去的十年中，高通量測序極大地?cái)U(kuò)大了我們對不同生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)菌群落的理解，雖然這種方法對于確定樣本中不同微生物類群的相對豐度很有價(jià)值，但是它并不能準(zhǔn)確提供不同樣本間目標(biāo)微生物豐度差異的信息。最近，研究人員開始使用絕對定量16S rRNA測序方法來解決這一領(lǐng)域的技術(shù)挑戰(zhàn)。本研究的目的是：1）用微生物絕對定量方法揭示不同施肥條件下鹽漬土細(xì)菌群落的變化，揭示土壤微生物組成與土壤化學(xué)性質(zhì)的關(guān)系。2）在番茄盆栽和田間試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，確定沿海鹽漬土生態(tài)系統(tǒng)可持續(xù)農(nóng)業(yè)發(fā)展的最佳施肥量。

田間試驗(yàn)場地及設(shè)計(jì)：

野外試驗(yàn)場位于江蘇省大豐市的潮坪地區(qū)，面對黃海，該地區(qū)屬北亞熱帶季風(fēng)氣候，四季分明，年平均降雨量1058毫米，年平均氣溫15°C，年平均日照2280小時(shí)，具有典型的濱海鹽漬土。本研究所采用的肥料為商業(yè)化生物有機(jī)肥（雞糞中添加10⁷孢子/g 的植物益生菌木霉菌NJAU 4742），化肥包括尿素、過磷酸鈣和硫酸鉀。設(shè)計(jì)了以下田間施肥處理：1）100%生物有機(jī)肥（100BF），2）70%生物有機(jī)肥和30%化肥（70BF），3）30%生物有機(jī)肥和70%化肥（30BF），4）100%化肥（CF）。每種施肥方式都有五個(gè)重復(fù)地塊，每個(gè)地塊為8.0 m²（4.0 m×2.0 m），長有21株4周齡的番茄幼苗。在2018年期間，番茄植株生長100天，并記錄了有關(guān)番茄產(chǎn)量數(shù)據(jù)，五個(gè)植株（帶水果）被從地里轉(zhuǎn)移到實(shí)驗(yàn)室。

盆栽試驗(yàn)設(shè)計(jì)：

為了更有效地研究不同施肥對鹽漬土微生物群的影響，從田間試驗(yàn)相同區(qū)域（0-20cm深）采集了200kg的土壤，并轉(zhuǎn)移到玻璃房進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。盆栽試驗(yàn)進(jìn)行了兩次，施肥處理與田間試驗(yàn)相同。每種處理有5個(gè)盆栽，每個(gè)盆栽含有2.8kg的土壤和1個(gè)番茄幼苗。在自然光條件下，隨機(jī)放置在20-30°C的玻璃室內(nèi)。種植后第42天，按照上述田間試驗(yàn)方法采集植物樣本，土壤樣本在同一天從每個(gè)盆栽中采集。

樣品制備和分析：

測定土壤化學(xué)性質(zhì)，包括土壤鹽漬度、土壤pH值、總磷、總鉀、硝態(tài)氮、有效磷和有效鉀。在田間試驗(yàn)和盆栽試驗(yàn)中，對每株植物的株高和莖粗進(jìn)行人工記錄，然后對植物樣品（莖和根）進(jìn)行干燥，以測量干重和進(jìn)行營養(yǎng)分析（如測定番茄果實(shí)中的維生素C含量、NO3-含量、總蛋白質(zhì)含量和可溶性糖含量）。

16S擴(kuò)增子絕對定量測序：

為了觀察施肥前后土壤微生物群的變化，未施肥初始土壤樣品也被納入分析。因此從盆栽試驗(yàn)的四個(gè)處理（CF、30BF、70BF和100BF）中收集的20個(gè)土壤樣品加上5個(gè)初始土壤樣品被送往上海天昊生物科技有限公司進(jìn)行細(xì)菌16S擴(kuò)增子絕對定量測序（V4-V5區(qū)域）。

 

研究結(jié)果：

田間試驗(yàn)番茄產(chǎn)量與品質(zhì)

•  鹽漬地番茄產(chǎn)量和果實(shí)品質(zhì)受施肥影響較大（表1）。在四種施肥方式中，70BF處理的番茄產(chǎn)量顯著最高。70BF處理使番茄產(chǎn)量分別比CF、30BF和100BF提高了17.2%、25.9%和23.6%。經(jīng)生物有機(jī)肥（BF）處理的番茄（30BF、70BF、100BF）其蛋白質(zhì)含量隨生物有機(jī)肥施用量的增加呈增長趨勢，而果實(shí)中硝酸鹽的積累呈相反的趨勢。四種處理間可溶性糖積累無顯著性差異。生物有機(jī)肥（BF）處理的番茄根系生長量比化肥（CF）處理的番茄根系生長量增加，表現(xiàn)為根系干生物量。

 

 表1田間試驗(yàn)中不同處理對番茄產(chǎn)量、品質(zhì)及根系生長的影響

•  此外，表2中所示的番茄植株生長和營養(yǎng)特性表明，生物有機(jī)肥施用（30BF、70BF、100BF）比化肥（CF）處理的植株生長更好，磷吸收更高。在三種BF處理中，70BF和100BF處理的株高顯著高于30BF。

 

表2田間試驗(yàn)中不同處理對番茄植株生長和營養(yǎng)的影響

盆栽試驗(yàn)中番茄生長及土壤性狀的研究

•   盆栽試驗(yàn)中番茄幼苗的生長（表3）證實(shí)了田間四種施肥方式對番茄生長影響的結(jié)果。此外，盆栽試驗(yàn)中30BF和CF處理的根系生長（以根系干重表示）比田間試驗(yàn)增加更顯著，而四種處理之間的莖徑無顯著差異。

 

表3盆栽試驗(yàn)中不同處理對番茄植株生長和營養(yǎng)的影響

• 同時(shí)，與初始未施肥土壤（CK）相比，四種施肥方式對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響有顯著性差異（圖1）。具體來說，土壤中的酸堿度、硝酸鹽氮和有效鉀(AK)呈明顯的下降趨勢，按CF>30BF>70BF>100BF的順序排列。經(jīng)生物有機(jī)肥（BF）改良后的土壤中的OM和有效磷(AP)明顯高于CF處理后的土壤和CK土壤。施肥土壤中的陽離子量（以ECe值表示），相對于對照樣品中的陽離子量，無論肥料輸入的形式如何，累積了3.3-3.8倍。

 

圖1盆栽試驗(yàn)中不同施肥處理對土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

土壤細(xì)菌群落的絕對定量

• 清除模糊、低質(zhì)量序列和singleton OTU后，25個(gè)土壤樣本共得到5,282,236條reads（含Spike-in序列），每個(gè)樣本生成的OTU數(shù)量從3124到4252不等，并由RDP數(shù)據(jù)庫進(jìn)一步分類。生成的OTU的維恩圖顯示了核心微生物群，所有樣本中共享3331個(gè)OTU。根據(jù)Spike-in生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行微生物絕對定量。

•  每克土壤的估計(jì)絕對拷貝數(shù)如圖2a所示，相應(yīng)的門水平相對豐度如圖2b所示。與未施肥的初始樣品（CK）相比，經(jīng)過肥料處理的樣品中細(xì)菌的總豐度增加了2.6-3.8倍，70BF樣品中細(xì)菌的總豐度顯著最高，其次是CF樣品。所有測試樣品中以Proteobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi, Actinobacteria, Firmicutes, Planctomycetes, Acidobacteria為優(yōu)勢菌門。

 

圖2 所有土壤樣品中主要細(xì)菌門的絕對豐度（A，每克土壤中16S rRNA基因拷貝數(shù)）和相對豐度（B，%）。

•  四種處理的土壤中細(xì)菌種類對施肥量的響應(yīng)不同，形成了具有不同α多樣性指數(shù)的群落（表S1），盡管施肥處理后的土壤細(xì)菌總數(shù)顯著增加，但這些樣品（CF、30BF、70BF和100BF）中的細(xì)菌多樣性較未處理土壤樣品（CK）明顯降低，其中，CF處理導(dǎo)致細(xì)菌多樣性的損失最大（顯示最低香農(nóng)值的多樣性）。
• 根據(jù)PCoA（按Bray Curtis計(jì)算，如圖3a所示）和平均連鎖層次聚類（UPGMA，按Bray Curtis計(jì)算，如圖3b所示），用PCo1（53.64%）將初始土壤（CK）的細(xì)菌群落與四種施肥土壤的細(xì)菌群落明顯分離；用PCo2（29.66%）將CF處理土壤的細(xì)菌群落與BF處理土壤的細(xì)菌群落明顯分離，相比之下，兩個(gè)較高的BF處理（70BF和100BF）不能清楚地彼此分離。

 

圖3 細(xì)菌群落的主坐標(biāo)分析（A，PCoA）和層次聚類樹（B）（以Bray Curtis計(jì)算）

•  屬水平上進(jìn)行的熱圖分析（圖4）也顯示細(xì)菌群落組成的集群模式與PCoA觀察到的集群模式相似。在施肥處理（CF和BF系列）中，大多數(shù)被選的菌屬（前100個(gè)）的絕對豐度明顯高于CK土壤，如圖所示，紅色/橙色柱狀物更多。此外，BF系列土壤的細(xì)菌組成比CF土壤中的細(xì)菌組成更均勻，如顏色強(qiáng)度所示。

 

圖4 土壤樣品中100個(gè)最豐富細(xì)菌屬的熱圖分析

 

細(xì)菌群落與土壤化學(xué)屬性的關(guān)系

• 為了確定影響本研究鹽漬土壤細(xì)菌群落組成的因素，進(jìn)行了RDA（圖5）和Pearson相關(guān)分析。土壤樣本根據(jù)門水平細(xì)菌群落組成分為三組（圖5）。第一組分（RDA1）從肥料處理樣品（CF和BF系列）中分離出初始土壤樣品（CK），解釋了70.59%的變化。第二組分（RDA 2）僅解釋了18.98%的變異，并從BF系列樣品中分離出了CF樣品。土壤酸堿度與大多數(shù)優(yōu)勢種呈負(fù)相關(guān)，其它5個(gè)土壤參數(shù)（包括土壤OM、EC、硝酸鹽N、有效磷和有效鉀）與細(xì)菌豐度呈正相關(guān)（圖5）。例如，肥料處理土壤中的Bacteroidetes和 Proteobacteria含量較高，與土壤EC含量較高呈正相關(guān)。有趣的是，在六個(gè)試驗(yàn)土壤參數(shù)中，土壤中的HE-OM比其他五個(gè)參數(shù)的重要性要小。而土壤養(yǎng)分有效性參數(shù)如有效磷、有效鉀、硝酸鹽N、土壤ECe對鹽漬土微生物群落的驅(qū)動(dòng)作用較強(qiáng)。

圖5  RDA確定了構(gòu)成細(xì)菌群落的六個(gè)選定環(huán)境變量。

•  此外，還計(jì)算了番茄根系生長與屬水平細(xì)菌絕對豐度的皮爾遜相關(guān)系數(shù)。根生物量與前30個(gè)屬中的15個(gè)（包括一些重要的屬，如Pseudomonas假單胞菌和Sphingopyxis）呈正相關(guān)，還包括5個(gè)屬（Gp6、Sphingomonas鞘膜單胞菌、Chitinophaga、Rhizobium根瘤菌和Flavisolibacter），這些屬只有在加載有機(jī)物后才會(huì)富集。