專(zhuān)屬含PCR抑制劑的環(huán)境樣本微生物拷貝數(shù)定量的最佳解決方案!

發(fā)稿時(shí)間：2019-06-04來(lái)源：天昊生物

腐植酸（Humic acid，HA）是動(dòng)植物遺骸，主要是植物的遺骸，經(jīng)過(guò)微生物的分解和轉(zhuǎn)化，以及地球化學(xué)的一系列過(guò)程造成和積累起來(lái)的一類(lèi)有機(jī)物質(zhì)。它的總量大得驚人，數(shù)以萬(wàn)億噸計(jì)。江河湖海，土壤煤礦，大部分地表上都有它的蹤跡。由于它的廣泛存在，所以對(duì)地球的影響也很大，涉及到碳的循環(huán)、礦物遷移積累、土壤肥力、生態(tài)平衡等方面。

 目前很多學(xué)者使用qPCR對(duì)環(huán)境樣本（例如土壤，水體和淤泥）中的微生物數(shù)量進(jìn)行絕對(duì)定量，但是研究發(fā)現(xiàn)腐殖酸廣泛地存在于以上環(huán)境樣本中，無(wú)論是基因組抽提前去除樣本中的腐殖酸還是在基因組抽提后去除基因組中殘留的腐殖酸都是很難將這些腐殖酸完全去除，這些殘留的腐殖酸會(huì)通過(guò)抑制酶的活性抑制PCR，從而影響qPCR結(jié)果的準(zhǔn)確性, 最終影響樣品中微生物數(shù)量的定量結(jié)果。

基于此，本測(cè)試通過(guò)研究不同微生物定量方法（qPCR絕對(duì)定量技術(shù)和天昊生物微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)）在有PCR抑制物（腐殖酸）存在的情況下，對(duì)樣本中微生物數(shù)量的定量準(zhǔn)確性的影響。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1、 樣本：

• 類(lèi)型1：將9種購(gòu)買(mǎi)的標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA按一定比例混合，標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA（S）
• 類(lèi)型2：土壤樣本，標(biāo)記為標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA（T）

2、 PCR抑制劑：

• 添加不同濃度腐殖酸（HA）至反應(yīng)體系中， HA 終濃度分別為 0ng/ul、10ng/ul、30ng/ul、50ng/ul；

表1 樣本信息說(shuō)明

3、 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：

•  添加不同濃度腐殖酸條件下進(jìn)行qPCR絕對(duì)定量實(shí)驗(yàn)，計(jì)算樣品的總細(xì)菌16S拷貝數(shù)；
• 添加不同濃度腐殖酸條件下進(jìn)行微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序?qū)嶒?yàn)，計(jì)算樣品的總細(xì)菌16S拷貝數(shù)；

4、 實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?/span>

• 探究腐殖酸對(duì)qPCR檢測(cè)細(xì)菌拷貝數(shù)的影響；
• 通過(guò)比較兩種方法計(jì)算的樣品總細(xì)菌拷貝數(shù)結(jié)果，探究在PCR抑制物存在的情況下，兩種方法的適用性；

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

 腐殖酸對(duì)qPCR檢測(cè)細(xì)菌拷貝數(shù)的影響 

• 根據(jù)測(cè)試結(jié)果可知，腐殖酸對(duì)qPCR 反應(yīng)確實(shí)具有抑制作用，這與腐殖酸是一種 PCR 抑制劑的結(jié)論一致；
• 當(dāng) qPCR 反應(yīng)體系中腐殖酸終濃度為 50ng/ul 時(shí)，抑制作用非常明顯；
•  因此若環(huán)境樣本中含有高濃度腐殖酸時(shí)，qPCR 計(jì)算的樣本拷貝數(shù)將與真實(shí)值存在較大偏差。

圖 2  添加不同濃度腐殖酸條件下qPCR檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA和土壤DNA樣本的總細(xì)菌16S拷貝數(shù)

16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序和 qPCR檢測(cè)細(xì)菌拷貝數(shù)時(shí)腐殖酸的影響對(duì)比

• 通過(guò)qPCR技術(shù)，無(wú)論是標(biāo)準(zhǔn)菌株DNA或土壤DNA樣本，反應(yīng)體系中腐殖酸終濃度為50ng/ul時(shí)，與不加腐殖酸的對(duì)照組相比，得到的兩組數(shù)據(jù)結(jié)果具有明顯差異；
• 通過(guò)天昊生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)，反應(yīng)體系中腐殖酸終濃度為50ng/ul時(shí)，與不加腐殖酸的對(duì)照組相比，得到的兩組數(shù)據(jù)結(jié)果無(wú)顯著差異；
• 造成以上結(jié)果的原因是：qPCR進(jìn)行細(xì)菌拷貝數(shù)定量時(shí)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品不含有腐殖酸而樣本則含有腐殖酸，并且兩者在兩個(gè)樣本孔中分別進(jìn)行各自的PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)效率不同，因此定量結(jié)果會(huì)有偏差。而天昊生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)進(jìn)行細(xì)菌拷貝數(shù)定量時(shí)，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線的標(biāo)準(zhǔn)品和樣本DNA是在同一個(gè)樣本孔中一起進(jìn)行PCR反應(yīng)，所以PCR反應(yīng)效率相同，因此校正了腐殖酸對(duì)PCR的影響，避免了腐殖酸等PCR抑制物對(duì)樣品細(xì)菌16S拷貝數(shù)定量的影響。

圖 3  16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序和qPCR檢測(cè)細(xì)菌拷貝數(shù)時(shí)腐殖酸的影響對(duì)比

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)總結(jié)

• 綜合以上數(shù)據(jù)結(jié)果，當(dāng)環(huán)境樣本中在有腐殖酸等PCR抑制物存在的情況下，天昊生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)計(jì)算得到的樣品細(xì)菌16S拷貝數(shù)更準(zhǔn)確，更適用。
• 天昊生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)是針對(duì)含PCR抑制劑環(huán)境樣本中微生物拷貝數(shù)絕對(duì)定量的最佳解決方案。 

以上就是天昊16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序部分更新內(nèi)容和亮點(diǎn)，當(dāng)然我們也會(huì)繼續(xù)升級(jí)有應(yīng)用價(jià)值的分析內(nèi)容，感興趣的小伙伴們可以關(guān)注天昊生物微信公眾號(hào)，小編會(huì)不定期更新哦。

客戶(hù)合作情況

作為國(guó)內(nèi)唯一一家提供 “微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序”技術(shù)的服務(wù)商，我們首先感謝客戶(hù)的信任和選擇，目前微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序技術(shù)平臺(tái)已經(jīng)完成項(xiàng)目近百個(gè)，合作的單位包括中國(guó)科學(xué)院南京土壤研究所、中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所、上海市環(huán)境科學(xué)研究院、廈門(mén)大學(xué)環(huán)境與生態(tài)學(xué)院、中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)、南京農(nóng)業(yè)大學(xué)、東北農(nóng)業(yè)大學(xué)、重慶市農(nóng)業(yè)科學(xué)院、鹽城工學(xué)院、南京財(cái)經(jīng)大學(xué)、南京中醫(yī)藥大學(xué)、武漢大學(xué)中南醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院、溫州醫(yī)科大學(xué)、山東大學(xué)齊魯醫(yī)院等多個(gè)單位，覆蓋環(huán)境微生物和腸道微生物等領(lǐng)域。

    2019年，我們期待，與您的合作！