單細胞轉(zhuǎn)錄組測序在跨物種（人、大鼠、小鼠、豬）腎內(nèi)細胞基因表達特征鑒定中的應用

發(fā)稿時間：2019-05-27來源：天昊生物

單細胞轉(zhuǎn)錄組測序（scRNA-seq）技術在不同物種、不同組織及發(fā)育階段中的應用越來越廣泛，今天就跟大家分享一篇剛剛在國際頂級腎臟病學期刊《Journal of the American Society of Nephrology》發(fā)表的研究論文，該文章用到了10x Genomics平臺探討不同物種間（人、大鼠、小鼠、豬）腎內(nèi)常駐巨噬細胞基因表達的特征。

 

Single-Cell RNA Sequencing Identifies Candidate Renal Resident Macrophage Gene Expression Signatures across Species

題目：單細胞RNA測序鑒定跨物種腎內(nèi)常駐巨噬細胞候選基因表達特征

發(fā)表雜志：J Am Soc Nephrol 影響因子：8.655  發(fā)表日期：2019-5

 

 

 

研究背景：

常駐巨噬細胞調(diào)節(jié)包括腎臟在內(nèi)的多種組織的穩(wěn)態(tài)和疾病過程。盡管有明確的標記來識別小鼠中的這些細胞，但技術限制阻止了不同物種間相似細胞類型的識別。無法識別跨物種的常駐巨噬細胞群阻礙了從動物模型獲得的數(shù)據(jù)向人類患者的轉(zhuǎn)化。本研究以小鼠、大鼠、豬和人腎組織中所有除去T細胞和B細胞的CD45⁺先天免疫細胞scRNAseq分析為切入點，確定能夠跨物種識別常駐巨噬細胞的新標記。

實驗材料及方法：

單細胞獲得

小鼠：取8周大C57BL/6野生型雄性小鼠腎臟，用無菌刀片切碎(約0.15克)，并在37℃酶液消化30分鐘。10x Genomics實驗中，3只野生型雄性小鼠腎臟樣本合并后用于測序。

大鼠：取3個月大的雄性Sprague–Dawley大鼠腎臟，稱取約2.5 g含有皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎組織。用無菌刀片將腎切碎，在37℃用酶液消化30分鐘。

豬：取6個月大的雄性豬腎臟。稱取約2.5 g含有皮質(zhì)和髓質(zhì)的腎組織。用無菌刀片將腎切碎，并在37℃用酶液消化30分鐘。

人：在切除后4小時內(nèi)從外科腎切除術中收集殘余的人腎組織。對于scRNAseq，從一名60歲白人男性獲得正常腎組織，其血清肌酐(0.8-1.2 mg/dl)正常，有外生性3厘米病變。在3名成年患者(平均年齡63 ± 8歲，兩名男性和一名女性，兩名白人和一名黑人)的相對未受影響的腎組織上驗證了由scRNAseq鑒定的標記。腎組織用無菌刀刀片將2.5 g含有皮質(zhì)和髓質(zhì)的組織切碎，并在37℃下酶液消化30分鐘。

消化后，腎臟碎片通過70微米過濾器，獲得單細胞懸浮液。細胞用溶液重懸，在室溫下用相應抗體染色30分鐘，小鼠：PE rat anti-mouse CD45，BV786 hamster anti-mouse CD3e和PerCP-Cy5.5 rat anti-mouse B220；大鼠：PE anti-rat CD45，APC anti-rat CD3和PE/Cy7 anti-rat CD45RA；豬：mouse anti-pig CD45和Fitc mouse anti-human CD3e，第二抗體包括Cy5 donkey anti-mouse IgG；人：Pacific Blue anti-human CD45，BV605 anti-human CD3和Alexa Fluor 647 anti-human CD19。所有物種都用Fixable Aqua Dead Cell Stain染色。加入一級抗體后，將細胞離心，在0.04% BSA中洗滌，再懸浮在1毫升0.04% BSA中。樣本被采集到流式細胞儀中，并使用Becton-Dickenson FACSAriaII進行分選。

Fluidigm C1測序

Fluidigm單細胞cDNA文庫制備。簡單地，F(xiàn)ACS分選后的巨噬細胞在Dulbecco-PBS中重新懸浮至最終濃度為300-350細胞/毫升，并與Fluidigm懸浮試劑混合，達到55%的最終浮力，這由預試驗確定。將6微升混合細胞裝載到Fluidigm C1 IFC平板中(10-17微米捕獲位點)，用于mRNA序列。捕獲的單細胞通過顯微鏡進行確認。接下來，裂解混合物、反轉(zhuǎn)錄混合物和預擴增混合物，最終構(gòu)建的文庫由Illumina Nextseq上測序。

10x Genomics

根據(jù)標準方法制備10x Chromium單細胞文庫。簡單地，F(xiàn)ACS分選的單細胞懸浮液、10x條形碼凝膠珠和油被裝載到Chip中，通過Chromium Controller捕獲凝膠珠乳液(GEMs)。全長cDNA文庫是通過在熱循環(huán)器中孵育GEMs制備的。將含有cDNA的GEMs破碎，并將所有單細胞cDNA文庫聚集在一起，用DynaBeads MyOne Silane beads通過聚合酶鏈反應進行預擴增，之后進行標準的測序文庫構(gòu)建，之后用Illumina Nextseq對最終構(gòu)建的單細胞文庫進行測序。

 

實驗結(jié)果：

1）scRNAseq揭示小鼠腎臟先天免疫細胞聚類的不同

實驗從腎臟中分離出除去淋巴細胞的免疫細胞群(CD45⁺)，并使用10x Genomics平臺對細胞進行scRNAseq分析(圖1A)。為了進行這項分析，研究者使用熒光標記抗體，排除了T細胞(小鼠和豬的CD3e，大鼠和人的CD3)和B細胞 (小鼠的B220，大鼠的CD45RA，人的CD19)。最終分別分析了來自小鼠、大鼠、豬和人腎臟組織的3013、3935、4671和2868個單細胞。使用無偏分級聚類和熱圖分析法顯示了每種物種獨特的內(nèi)免疫細胞圖譜，每種顏色代表不同的細胞群體(圖1B和1C)。

 

圖1、scRNAseq識別腎臟先天免疫中具有獨特基因表達模式的細胞群。(A)實驗設計示意圖。(B)小鼠、大鼠、豬和人腎臟先天免疫細胞的tSNE圖和(C)熱圖。

 

為了理解先天免疫細胞的保護并確定這些細胞在不同物種間的標記，研究者首先使用自已發(fā)表文獻和在線數(shù)據(jù)庫的先天免疫細胞群體的標準標記，從小鼠scRNAseq數(shù)據(jù)中分離細胞群體。使用指定的基因，通過tSNE圖和小提琴圖來識別小鼠腎中不同類型先天免疫細胞（圖2）。

 

圖2、經(jīng)典標記可用于識別小鼠腎臟中不同的先天免疫細胞簇。tSNE投影和伴隨的小提琴圖描繪了用于鑒定(A)嗜中性粒細胞(Lcn2)，(B)自然殺傷細胞(Gzma)，(C)免疫球蛋白樣細胞(Il7r)，(D)免疫球蛋白樣細胞(Itgam，Ccr2)，(E)常駐巨噬細胞(Adgre1，Cd64)和(F)樹突狀細胞(Snx22，Batf3)的基因。

 

2）比較分析確定富集于常駐巨噬細胞新的基因

使用上面的標記基因，研究者手工注釋tSNE圖中用于檢測小鼠腎臟中已知的先天免疫細胞群(圖3A)。結(jié)果強調(diào)了小鼠腎臟中嗜中性粒細胞、自然殺傷細胞、白細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞的不同簇的存在。為了鑒定小鼠腎臟先天免疫細胞的新標記基因，研究者使用Seurat來鑒定圖3A中每個細胞群中存在的最高差異表達基因。用這種方法確定了一系列候選基因，它們的表達在小鼠的每一個先天免疫部分都很豐富，并且包括已知和未知的標記(圖3B)。使用這種無偏方法，識別幾種特異性表達轉(zhuǎn)錄物，以及胚胎來源的常駐巨噬細胞(圖3C)。

 

 

圖3、scRNAseq可用于鑒定小鼠腎臟先天免疫細胞的新標記。(A)根據(jù)圖2中確定的典型基因的表達，對小鼠腎臟的單細胞進行人工注釋。(B)識別每個先天免疫細胞中新基因表達特征的熱圖。(C) 不同細胞中的新基因的tSNE和小提琴圖。

 

3) 使用Fluidigm C1序列驗證10x Genomics數(shù)據(jù)

為了進一步驗證10x Genomics尋找的新標記物，本研究使用流式細胞儀根據(jù)常規(guī)標記物對有限和常駐巨噬細胞群進行分選，并使用Fluidigm C1技術進行scRNAseq分析。C1數(shù)據(jù)的主成分分析圖、小提琴圖和熱圖分析表明，有限和常駐巨噬細胞表達獨特的基因特征，與10x Genomics相匹配(圖4A-C)。

 

 

圖4、Fluidigm C1 scRNAseq可在小鼠常駐巨噬細胞中檢測到DEGs。(A)主成分分析圖，(B)小提琴圖和(C)熱圖。

 

4) scRNAseq揭示物種間常駐巨噬細胞基因表達模式的保守性

接下來，研究者評估在從大鼠、豬和人腎臟分離的CD45⁺陰性先天免疫細胞中是否可以發(fā)現(xiàn)相似的基因表達模式。首先選擇用于明確識別小鼠中常駐巨噬細胞的最高差異表達基因 (C1qc)，并在每個物種的序列數(shù)據(jù)中尋找該基因的存在。值得注意的是，tSNE和小提琴圖顯示了在來自小鼠、大鼠、豬和人類組織的單細胞數(shù)據(jù)中富含C1qc表達的獨特細胞群的存在(圖5A)。為了測試候選常駐巨噬細胞基因表達模式是否存在于不同物種中，研究者搜索了在小鼠常駐巨噬細胞中富集的來自大鼠、豬和人腎組織的單細胞數(shù)據(jù)另外三種頂級差異表達基因(Cd81，Cd74，Apoe)。tSNE和小提琴圖顯示，每個基因在每個物種的一個共同細胞群中發(fā)現(xiàn)(圖5B-D)。這些數(shù)據(jù)表明候選常駐巨噬細胞基因表達模式可能在跨物種常駐巨噬細胞中保守。

 

圖5、scRNAseq數(shù)據(jù)識別了多種物種中獨特的細胞群，這些細胞群與小鼠體內(nèi)的巨噬細胞具有相同的基因表達模式。

 

然后研究者人工將細胞分為嗜中性粒細胞、自然殺傷細胞、巨噬細胞、常駐巨噬細胞和樹突狀細胞(圖6)。

 

 

圖6、scRNAseq識別不同的腎先天免疫細胞。(A)人工注釋的小鼠、大鼠、豬和人先天免疫區(qū)室的tSNE圖。(B)tSNE和小提琴圖，顯示了常用的人巨噬細胞標志物(CD68、CD163、CD14、FCGR3A)在人腎組織的scRNAseq數(shù)據(jù)中的表達。

 

本研究使用scRNAseq數(shù)據(jù)來鑒定小鼠常駐巨噬細胞的新標志物，這些標志物可能存在于跨物種的候選常駐巨噬細胞上。為了證實鑒定的新標記物富集在小鼠腎常駐巨噬細胞中，研究者對從野生型小鼠腎中獲得的單細胞進行了分類，并尋找新的識別巨噬細胞標記物(C1q，CD81，CD74，Apoe)的存在。作為對照，我們還分析了這些標記在免疫巨噬細胞中的表達。流式細胞儀數(shù)據(jù)分析表明，與有限巨噬細胞相比，常駐巨噬細胞中表達C1q、CD81和CD74的細胞數(shù)量和平均熒光強度增強(圖7)。

 

 

圖7、由scRNAseq鑒定的基因在蛋白質(zhì)水平上富集在小鼠體內(nèi)的巨噬細胞中。

 

5）使用新標記識別的常駐巨噬細胞與外周血的交換最少

為了確定使用新方法鑒定的候選常駐巨噬細胞缺乏與外周血的交換，這是組織常駐巨噬細胞的特征，研究者在CD45同源小鼠(CD45.2和CD45.1)中應用了共生模型。我們的數(shù)據(jù)表明，使用新標記物鑒定的候選常駐巨噬細胞嵌合率為2%-6%?？偟膩碚f，本研究數(shù)據(jù)證實，使用新標記物確定為候選常駐巨噬細胞的細胞群被小鼠外周血細胞所替代的程度最低。

 

研究結(jié)論：

1、利用scRNAseq技術鑒定了小鼠腎常駐巨噬細胞中表達豐富的基因。

2、使用scRNAseq數(shù)據(jù)為這些候選腎常駐巨噬細胞確定了一組新的細胞表面標記。

3、除小鼠外，在人、大鼠、豬等多種物種中鑒定了腎常駐巨噬細胞。

 

 

關于天昊

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