10x Genomics單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序在動(dòng)物腦組織研究中的應(yīng)用

發(fā)稿時(shí)間：2019-05-23來(lái)源：天昊生物

自從2017年1月發(fā)表的Nature Communications文章，首次基于10x Genomics平臺(tái)對(duì)29個(gè)樣本的約25萬(wàn)個(gè)細(xì)胞進(jìn)行大規(guī)模單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）以來(lái)，利用該平臺(tái)針對(duì)人類和動(dòng)物不同組織和發(fā)育過程，發(fā)表的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序高分文章便出現(xiàn)爆發(fā)式增長(zhǎng)，今天就跟大家梳理一下10x Genomics單細(xì)胞RNA測(cè)序在小鼠、果蠅、斑馬魚等動(dòng)物腦組織研究中的應(yīng)用。

 

1、A Single-Cell Transcriptome Atlas of the Aging Drosophila Brain

題目：果蠅大腦老化單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組圖譜

發(fā)表雜志：Cell 影響因子：31.398  發(fā)表日期：2018-8-9

 

 

研究?jī)?nèi)容：

通過對(duì)成年果蠅大腦單細(xì)胞圖譜檢測(cè)，確定了神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞類型及其在衰老過程中的動(dòng)態(tài)變化情況。

實(shí)驗(yàn)材料：

所有果蠅在25oC、12h/12h光照周期的酵母培養(yǎng)基上飼養(yǎng)。在老化實(shí)驗(yàn)中，每個(gè)小瓶中放入20只雌性和10只雄性果蠅，每4天將果蠅轉(zhuǎn)移到新的小瓶中。成年果蠅在0、1、3、6、9、15、30和50天大時(shí)被使用。

實(shí)驗(yàn)方法：

大腦單細(xì)胞分離

將40只果蠅大腦(20只雌性和20只雄性)解剖并轉(zhuǎn)移到含有冰冷DPBS溶液的試管中。離心5分鐘后，上清液被dispase和collagenase替換。大腦在25oC中以1000轉(zhuǎn)/分鐘速度解離2h。用冰冷的DPBS溶液洗滌細(xì)胞，并在DPBS BSA中再懸浮30-40個(gè)大腦。細(xì)胞懸液通過pluriStrainer (ImTec Diagnostics_435001050)儀器。細(xì)胞活力和濃度由LUNA-FL雙熒光細(xì)胞計(jì)數(shù)器評(píng)估。

分離后的單細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)10x Genomics單細(xì)胞分選。此外，本研究還用到了免疫熒光、ATAC-seq、細(xì)胞核分離、Bulk RNA-seq、SMART-Seq2和CEL-Seq2等方法。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1）成年果蠅大腦scRNA-seq及細(xì)胞類型鑒定

本研究使用10x Genomics平臺(tái)，對(duì)8個(gè)不同時(shí)間點(diǎn)的果蠅成年大腦單細(xì)胞進(jìn)行分選測(cè)序。最終獲得56902 (57K)個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞數(shù)據(jù)(DGRP-551約29K個(gè)細(xì)胞，w1118約28K個(gè)細(xì)胞)。在所有細(xì)胞中檢測(cè)到的基因總數(shù)為12436個(gè)蛋白質(zhì)編碼基因和2164個(gè)非編碼核糖核酸。每個(gè)細(xì)胞的基因中位值在1308 (0天)到810 (50天)之間。根據(jù)分辨率的不同，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行聚類后得出87–151個(gè)細(xì)胞聚類（圖1）。

研究者通過名為SCope的在線資源提供所有集群信息和每個(gè)集群的標(biāo)記。使用兩種方法將細(xì)胞群與已知的細(xì)胞類型聯(lián)系起來(lái)，包括a）將每個(gè)細(xì)胞群的識(shí)別標(biāo)記與先前公布的已知細(xì)胞類型的標(biāo)記基因進(jìn)行比較的方法，以及b）將單細(xì)胞群中的基因表達(dá)與之前發(fā)表的果蠅大腦亞群轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較，通過回歸模型擬合獲得高度相似性細(xì)胞簇。

 

 

圖1、單細(xì)胞RNA測(cè)序鑒定的成熟果蠅大腦細(xì)胞類型分析（57000個(gè)腦細(xì)胞t-SNE圖）

2）利用靶向細(xì)胞分選和亞聚類鑒定稀有細(xì)胞類型

為了鑒定未標(biāo)記的細(xì)胞簇并將它們映射到特定的神經(jīng)元群體上，利用已知的Gal4系可用于在特定的細(xì)胞群體中表達(dá)綠色熒光蛋白，進(jìn)行FAC(熒光激活細(xì)胞)分選和分析，通過CEL-Seq2和SMART-Seq2方法檢測(cè)出更多基因，并成功對(duì)細(xì)胞類型進(jìn)行了鑒定。

3）利用SCENIC繪制細(xì)胞類型特異性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

研究者對(duì)鑒定的細(xì)胞類型所具有的特定基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)和轉(zhuǎn)錄因子活性特征進(jìn)行了分析，為此開發(fā)了SCENIC數(shù)據(jù)庫(kù)，并發(fā)現(xiàn)了150個(gè)轉(zhuǎn)錄因子識(shí)別基序在共表達(dá)的基因集中顯著富集。與Seurat相比，使用這些基因網(wǎng)絡(luò)(而不是單獨(dú)的基因表達(dá))的細(xì)胞聚類產(chǎn)生了不同的t-SNE投影。結(jié)果表明，大量神經(jīng)元具有共同的調(diào)節(jié)狀態(tài)。

4）中樞大腦的調(diào)節(jié)狀態(tài)可以預(yù)測(cè)氧化磷酸化水平

研究者通過探索調(diào)節(jié)子活性矩陣的PCA進(jìn)一步研究了SCENIC t-SNE。結(jié)果表明，基于推斷的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的細(xì)胞聚類可以對(duì)神經(jīng)元進(jìn)行分組。為了探討這種細(xì)分是否反映了功能差異，本研究評(píng)估了三個(gè)神經(jīng)元組之間的差異基因表達(dá)譜，然后進(jìn)行GO富集分析，并通過對(duì)線粒體翻譯相關(guān)基因分析最終表明，衰老影響基因豐度。然而細(xì)胞類型保持不變。參與氧化磷酸化和線粒體周轉(zhuǎn)的基因下降最快。

5）SCope：基于云的單細(xì)胞細(xì)胞圖譜工具

研究者最后開發(fā)了一個(gè)用戶友好的在線應(yīng)用工具SCope (http://scope.aertslab.org)。提供了果蠅、小鼠及人類等腦細(xì)胞單細(xì)胞數(shù)據(jù)集。

 

2、Comprehensive Identification and Spatial Mapping of Habenular Neuronal Types Using Single-Cell RNA-Seq

題目：?jiǎn)渭?xì)胞RNA測(cè)序?qū)\核神經(jīng)元類型的綜合識(shí)別和空間定位

發(fā)表雜志：Current Biology 影響因子：8.851  發(fā)表日期：2018-4-2

 

 

 

 

研究?jī)?nèi)容：

本研究使用scRNA-seq來(lái)鑒定了幼年和成年斑馬魚韁核中不同的神經(jīng)元類型。

實(shí)驗(yàn)材料：

幼年和成年斑馬魚生長(zhǎng)在25oC、12h/12h光照周期環(huán)境中。在實(shí)驗(yàn)中使用受精后10天的幼年仔魚和1歲左右的成年雄性和雌性斑馬魚。

實(shí)驗(yàn)方法：

10x Genomics相關(guān)細(xì)胞分離和文庫(kù)制備

解剖來(lái)自25條gng8-GFP魚的頭部，分離細(xì)胞如前所述。將大約6000-8000個(gè)細(xì)胞立即分選到20微升PBS中。分選是用貝克曼MoFlo Astrios超高速流式分選系統(tǒng)進(jìn)行的，分選壓力在20psi。這是一個(gè)關(guān)鍵的步驟，因?yàn)楦叩姆诌x壓力導(dǎo)致分選后過量的細(xì)胞死亡。所得單細(xì)胞懸液被迅速裝載到10x Genomics系統(tǒng)中。分選后的細(xì)胞在冰上保存不超過10分鐘，因?yàn)橥ㄟ^臺(tái)盼藍(lán)染色測(cè)量的細(xì)胞生存力隨時(shí)間下降。

對(duì)于成年魚的實(shí)驗(yàn)，基于gng8-GFP標(biāo)記的表達(dá)，將6個(gè)成年韁核直接從大腦中解剖出來(lái)。木瓜蛋白酶酶解后，將所得細(xì)胞在PBS+BSA中洗滌一次，并通過20微米細(xì)胞過濾器過濾。然后重懸細(xì)胞后在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器上計(jì)數(shù)。通過臺(tái)盼藍(lán)染色評(píng)估細(xì)胞活力，并在確保懸浮細(xì)胞活力大于80%后，將細(xì)胞以約300細(xì)胞/微升的濃度裝載到10x Genomics系統(tǒng)中。10x Genomics文庫(kù)構(gòu)建根據(jù)廠商說明進(jìn)行。

SMART-seq2相關(guān)細(xì)胞分離及文庫(kù)制備

幼魚頭部解剖切割后，使用Papain Dissociation Kit迅速解離，酶解后將細(xì)胞重新懸浮在EBSS溶液中。得到的細(xì)胞懸液通過20微米細(xì)胞過濾器并置于冰上。加入兩種活力指示劑(calcein blue活細(xì)胞染色劑和ethidium homodimer死細(xì)胞染色劑)。如果通過calcein blue染色測(cè)量的細(xì)胞存活率大于85%，則立即將細(xì)胞直接分選到含有裂解緩沖液的96孔板中。所有樣品立即冷凍在干冰中，并儲(chǔ)存在-80℃直至進(jìn)一步處理。

為了制備SMART-seq2文庫(kù)，將含有單細(xì)胞裂解物的平板在冰上解凍，用beads純化。然后將beads風(fēng)干并迅速加工用于合成cDNA。SMART-seq2文庫(kù)使用常規(guī)方法進(jìn)行。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

1）斑馬魚幼體單神經(jīng)元的分離和轉(zhuǎn)錄譜分析

由于scRNA-seq以前沒有應(yīng)用于斑馬魚神經(jīng)元，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)并優(yōu)化了一個(gè)從斑馬魚大腦中分離和捕獲單個(gè)神經(jīng)元的方案。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，成功的實(shí)驗(yàn)需要溫和的研磨，減少解離后的處理時(shí)間，以及熒光激活細(xì)胞分選(FACS)過程中最小的分選壓力。實(shí)驗(yàn)使用gng8-GFP轉(zhuǎn)基因系對(duì)韁核細(xì)胞進(jìn)行分類，該轉(zhuǎn)基因系選擇性地標(biāo)記韁核中的大多數(shù)神經(jīng)元（圖1）。

 

圖1、scRNA-Seq數(shù)據(jù)的無(wú)偏聚類確定了幼體韁核中15個(gè)分子不同的神經(jīng)元簇

使用兩個(gè)互補(bǔ)的scRNA-Seq平臺(tái)(圖1B：(1)基于大規(guī)模平行液滴的3’端scRNA-Seq (商業(yè)10x Chromium平臺(tái))和(2)低通量基于平板的全長(zhǎng)scRNA-Seq (SMART-Seq2)。使用基于液滴的scRNA-seq從4365個(gè)幼體細(xì)胞中獲得數(shù)據(jù)，使用SMART-seq2(以下簡(jiǎn)稱SS2數(shù)據(jù)集)從1152個(gè)幼體細(xì)胞中獲得數(shù)據(jù)。盡管斑馬魚神經(jīng)元中的核糖核酸水平很低，本實(shí)驗(yàn)平均檢測(cè)到1350個(gè)(液滴法)和3850 (SS2法)個(gè)基因/細(xì)胞。因此，多個(gè)scRNA- seq平臺(tái)可以有效地應(yīng)用于斑馬魚大腦中的神經(jīng)元。

2）鑒定了15個(gè)轉(zhuǎn)錄上不同的聚類簇

在幼體韁核中，為了識(shí)別神經(jīng)元類型使用了液滴數(shù)據(jù)集法。在4233個(gè)過濾細(xì)胞中獲得13160個(gè)基因的基因表達(dá)矩陣。對(duì)1436個(gè)可變基因的基因表達(dá)矩陣進(jìn)行了PCA分析，鑒定出36個(gè)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的主成分。這些計(jì)算機(jī)被用來(lái)建立細(xì)胞的k最近鄰圖，然后使用算法將其劃分為14個(gè)轉(zhuǎn)錄不同的聚類，并用t-分布隨機(jī)鄰域嵌入(t-SNE)將所得的16個(gè)聚類二維可視化(圖1C)，并評(píng)估差異基因表達(dá)以鑒定聚類特異性標(biāo)記(圖1D)。

3）大多數(shù)先前描述的特異性基因在多個(gè)神經(jīng)元簇中廣泛表達(dá)

為了理解我們的簇特異性標(biāo)記如何與先前描述的韁核基因相關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)了三種基因表達(dá)模式。首先，一些已知基因顯示出與單個(gè)簇幾乎完全重疊，并且通過我們的分析也獨(dú)立地被鑒定為簇特異性標(biāo)記。其次，一些已知標(biāo)記韁核背側(cè)亞結(jié)構(gòu)域的基因跨越了幾個(gè)簇。第三，大多數(shù)先前報(bào)道的韁核內(nèi)區(qū)域表達(dá)模式的基因在多個(gè)簇。通過核糖核酸熒光原位雜交(FISH)驗(yàn)證了這些經(jīng)典標(biāo)記與多個(gè)簇的重疊，證明了據(jù)報(bào)道空間受限的單個(gè)基因可以跨越多個(gè)神經(jīng)元亞型。

此外，本研究對(duì)幼年和成年之間神經(jīng)元類型的保留進(jìn)行了探討，成功構(gòu)建了相關(guān)單細(xì)胞基因表達(dá)圖譜。

 

3、Single-Cell Transcriptomics Analyses of Neural Stem Cell Heterogeneity and Contextual Plasticity in a Zebrafish Brain Model of Amyloid Toxicity

題目：斑馬魚淀粉樣蛋白毒性腦模型神經(jīng)干細(xì)胞異質(zhì)性和上下文可塑性的單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

發(fā)表雜志：Cell Reports 影響因子：8.032  發(fā)表日期：2019-4-23

 

 

 

研究?jī)?nèi)容概述：

斑馬魚大腦通過產(chǎn)生更多來(lái)自神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)元來(lái)對(duì)抗阿爾茨海默病。本研究通過使用單細(xì)胞測(cè)序技術(shù)，在成年斑馬魚大腦中識(shí)別出對(duì)阿爾茨海默病樣癥狀有不同反應(yīng)的不同干細(xì)胞群，并開發(fā)出研究其分子機(jī)制的程序工具。

實(shí)驗(yàn)材料：

表達(dá)GFP的轉(zhuǎn)基因斑馬魚用于分選祖細(xì)胞和端腦的其余部分。受精后6個(gè)月的雌魚用于分析。

實(shí)驗(yàn)方法：

10x Genomics scRNA-Seq

實(shí)驗(yàn)結(jié)論：

 

圖1、斑馬魚腦細(xì)胞分選和細(xì)胞類型歸類

1）單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)揭示斑馬魚神經(jīng)干細(xì)胞/神經(jīng)膠質(zhì)的異質(zhì)性

2）不同的干細(xì)胞群可以在空間和分子層面上定義

3）Amyloid-b-42和白細(xì)胞介素-4誘導(dǎo)某些祖細(xì)胞群體的可塑性

4）相互作用圖譜預(yù)測(cè)調(diào)節(jié)神經(jīng)干細(xì)胞可塑性的途徑

 

4、Developmental Diversification of Cortical Inhibitory Interneurons

題目：皮層抑制中間神經(jīng)元的發(fā)育多樣化

發(fā)表雜志：Nature 影響因子：41.577  發(fā)表日期：2018-5-22

 

 

研究?jī)?nèi)容概述：

皮質(zhì)中間神經(jīng)元的不同子集在高階大腦功能中起著至關(guān)重要的作用。為了研究這種多樣性是如何產(chǎn)生的，本研究使用scRNA-Seq來(lái)描述在發(fā)育過程中的小鼠腦細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。

實(shí)驗(yàn)材料：

野生型和轉(zhuǎn)基因雄性及雌性小鼠。

實(shí)驗(yàn)方法：

10x Genomics scRNA-Seq，SMART-seq2等。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論：

神經(jīng)節(jié)突起中有絲分裂祖細(xì)胞的異質(zhì)性是由高度保守的成熟軌跡驅(qū)動(dòng)的，同時(shí)突起特異性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)孕育了后來(lái)多樣性的出現(xiàn)。在有絲分裂后，祖細(xì)胞分化并分化成轉(zhuǎn)錄上不同的狀態(tài)，包括中間神經(jīng)元前體狀態(tài)。通過跨發(fā)育時(shí)間點(diǎn)整合數(shù)據(jù)集，發(fā)現(xiàn)了成體中間神經(jīng)元及其前體之間轉(zhuǎn)錄組異質(zhì)性的共同來(lái)源，并揭示了主要中間神經(jīng)元亞型的胚胎出現(xiàn)。本研究分析顯示，轉(zhuǎn)錄因子Mef2c與各種神經(jīng)精神和神經(jīng)發(fā)育障礙相關(guān)，描述了表達(dá)細(xì)小白蛋白的神經(jīng)元的早期前體，對(duì)其發(fā)育至關(guān)重要。這些發(fā)現(xiàn)為早期抑制前體的分子多樣性提供了新的線索，并確定了可能影響人類中間神經(jīng)元亞型的基因模塊。

 

圖1、小鼠神經(jīng)節(jié)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序圖譜

 

5、A Single-Cell Transcriptional Atlas of the Developing Murine Cerebellum

題目：發(fā)育中的小鼠小腦單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜

發(fā)表雜志：Current Biology 影響因子：8.851  發(fā)表日期：2018-9-24

 

研究?jī)?nèi)容概述：

小腦由數(shù)量有限的細(xì)胞類型發(fā)展而來(lái)，這些細(xì)胞類型精確地組織形成控制感覺-運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)和一些高階認(rèn)知過程。本研究創(chuàng)建了發(fā)育中的鼠小腦單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄圖譜，由來(lái)自12個(gè)時(shí)間點(diǎn)的39245個(gè)細(xì)胞組成。主要小腦譜系被鑒定，已知的和新的假定轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子也被鑒定。數(shù)據(jù)集被集成到基于網(wǎng)絡(luò)界面Cell Seek中用于交互式探索。

實(shí)驗(yàn)材料與方法：

對(duì)小鼠發(fā)育過程12個(gè)時(shí)間點(diǎn)小腦組織進(jìn)行分離。這些時(shí)間點(diǎn)包括小鼠出生前每天間隔的八個(gè)e10和e17胚胎時(shí)間點(diǎn)以及出生后的P0、P4、P7和P10四個(gè)時(shí)間點(diǎn)的腦組織樣本。對(duì)于胚胎時(shí)間點(diǎn)，同一窩的小腦在每個(gè)實(shí)驗(yàn)中被組合，而出生后的時(shí)間點(diǎn)每窩只使用一只幼鼠。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)使用兩個(gè)獨(dú)立的重復(fù)進(jìn)行。小腦在木瓜蛋白酶溶液中解離30分鐘，在Neurobasal中沖洗，并用40微米過濾器過濾。細(xì)胞用0.4% BSA的PBS中重懸。用LUNA自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)器對(duì)用Acridine Orange/Propidium Iodide染色的細(xì)胞濃度和生存力進(jìn)行評(píng)估，之后進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的 10x Genomics scRNA-Seq檢測(cè)分析。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論：

本研究在12個(gè)關(guān)鍵發(fā)育時(shí)間點(diǎn)對(duì)39245個(gè)小鼠小腦細(xì)胞進(jìn)行了scRNA-Seq。使用公認(rèn)的譜系標(biāo)記，證實(shí)單細(xì)胞數(shù)據(jù)準(zhǔn)確地概括了小腦的發(fā)育。然后通過遷移和分化跟蹤不同群體的出現(xiàn)，并確定相關(guān)的轉(zhuǎn)錄級(jí)聯(lián)。在確定關(guān)鍵譜系承諾決策后，集中分析揭示了在這些分支點(diǎn)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的波動(dòng)。最后，創(chuàng)建了Cell Seek，這是一個(gè)靈活的在線界面，有助于數(shù)據(jù)集的探索。本研究提供了單細(xì)胞分辨率下小腦發(fā)育的轉(zhuǎn)錄總結(jié)，這將為小腦發(fā)育、神經(jīng)生物學(xué)和疾病的未來(lái)研究提供有價(jià)值的資源。

 

 

 

關(guān)于天昊

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