新英格蘭醫(yī)學(xué)：GLS中STR擴(kuò)增引起的谷氨酰胺酶缺乏

發(fā)稿時(shí)間：2019-05-06來源：天昊生物

摘要： STR與疾病關(guān)系最新突破

2019年4月11日，新英格蘭醫(yī)學(xué)在線發(fā)表了一篇題為“Glutaminase Deficiency Caused by Short Tandem Repeat Expansion in GLS”的文章，再次聚焦由編碼谷氨酰胺酶(GLS)基因5’非翻譯區(qū)的GCA重復(fù)序列的STR擴(kuò)增引起的遺傳性代謝缺陷病。

 

近年來，關(guān)于STR與疾病及癌癥的關(guān)聯(lián)機(jī)制研究屢發(fā)好文，2018年4月，PNAS發(fā)表了微衛(wèi)星擴(kuò)增誘導(dǎo)了內(nèi)含子的保留可以作為疾病生物標(biāo)志物的文章。6月，天昊基因科技（蘇州）有限公司與浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院（浙醫(yī)二院）神經(jīng)內(nèi)科羅巍教授合作，發(fā)表于國際臨床神經(jīng)病學(xué)及神經(jīng)科學(xué)頂級期刊Brain的文章 “Intronic pentanucleotide TTTCA repeat insertion in the SAMD12 gene causes familial cortical myoclonic tremor with epilepsy type 1”，首次報(bào)道了中國人群SAMD12基因內(nèi)含子區(qū)五核苷酸（TTTCA）重復(fù)插入導(dǎo)致家族性皮層肌陣攣性震顫癲癇1型。9月，Cell雜志又以Article形式報(bào)道了重量級研究成果，發(fā)現(xiàn)疾病相關(guān)短串聯(lián)重復(fù)序列（STR）與染色質(zhì)結(jié)構(gòu)域邊界之間密切相關(guān)。此外，關(guān)于微衛(wèi)星不穩(wěn)定性MSI與癌癥關(guān)系的文章也有大量報(bào)道。

 

回到NEJM這篇文章，本研究通過詳細(xì)的臨床和生化表型分析，利用全基因組測序，在三名無關(guān)患者中觀察到了這種STR擴(kuò)增現(xiàn)象，他們表現(xiàn)為早發(fā)性整體發(fā)育遲緩、進(jìn)行性共濟(jì)失調(diào)和谷氨酰胺水平升高。除了共濟(jì)失調(diào)，有一名患者還存在小腦萎縮癥狀。這種擴(kuò)增與其轉(zhuǎn)錄的GLS mRNA相對缺乏有關(guān)，這可能是位于GLS重復(fù)序列上游，由重復(fù)序列介導(dǎo)的染色質(zhì)改變造成的。

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病例報(bào)告

三名不相關(guān)的患者均出生于歐洲血統(tǒng)，父母為白人，無妊娠和分娩后并發(fā)癥，年齡分別為3歲（1號和2號患者來自英國）和2歲（3號患者來自加拿大），在粗大運(yùn)動技能和精細(xì)運(yùn)動技能方面均出現(xiàn)早發(fā)性遲緩，以及言語障礙。早期大腦成像沒有顯示異常，在11歲時(shí)，在重復(fù)磁共振成像中發(fā)現(xiàn)患者3患有小腦萎縮。

實(shí)驗(yàn)方法

測序和基因組分析

從外周血中分離基因組DNA，在從家系1和3獲得的樣本中進(jìn)行母親、父親和先證者的外顯子組測序，而從家系2獲得的樣本進(jìn)行母親和先證者的外顯子組測序。此外，對從家系1中的先證者獲得的樣品進(jìn)行全基因組測序。經(jīng)過對測序數(shù)據(jù)的分析，以及一代測序確認(rèn)了錯(cuò)義和移碼變體，通過重復(fù)引物PCR（或稱三引物PCR）和GLS重復(fù)PCR確認(rèn)STR擴(kuò)增的存在。

生物化學(xué)分析

在含有谷氨酰胺反應(yīng)混合物中測定成纖維細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞中的GLS活性，利用分光光度法測定。

功能實(shí)驗(yàn)

研究者進(jìn)行了染色質(zhì)分析、焦磷酸測序并將GLS啟動子克隆到熒光素酶報(bào)告載體中，以研究重復(fù)擴(kuò)增對轉(zhuǎn)錄和翻譯的影響。對從患者獲得的樣本進(jìn)行酶促分析、免疫印跡、互補(bǔ)及晶體結(jié)構(gòu)等功能分析。

 

實(shí)驗(yàn)結(jié)果

代謝發(fā)現(xiàn)

對三名患者進(jìn)行代謝評估發(fā)現(xiàn)，盡管血漿氨水平正常，但血漿谷氨酰胺超過正常范圍(405至781μmol/L)的上限2.5倍。三名患者的父母和兄弟姐妹血漿谷氨酰胺水平在正常范圍內(nèi)。

外顯子組測序

研究使用臨床基因檢測Panel排除了尿素循環(huán)障礙?；谶@些患者可能存在新的遺傳性代謝缺陷的假設(shè)，研究者對家系1(先證者和雙親)和家系2(先證者和單親)進(jìn)行了外顯子組測序和分析，并且獨(dú)立分析了家系3 (先證者和雙親)的數(shù)據(jù)。結(jié)果未鑒定出任何主要的候選基因。然后我們評估家系1和家系2中先證者的外顯子組測序結(jié)果，罕見雜合子狀態(tài)的有害變異分別在345和320個(gè)基因中被鑒定到，其中24和29個(gè)與人類智力障礙或腦病有關(guān)，特別的關(guān)注到了編碼谷氨酰胺酶的GLS中的父系遺傳變體c.938C→T(p.Pro313Leu；NM_014905)。在家系2中，研究者沒有發(fā)現(xiàn)符合臨床或生化表型的候選變異。在另一項(xiàng)研究中，外顯子組分析揭示了患者3中一個(gè)GLS母系遺傳雜合變體c.923dupA (p.Tyr308*；NM_014905) (圖1A)。在患者1和患者3中發(fā)現(xiàn)的錯(cuò)義和移碼GLS變異，都被預(yù)測為具有破壞性。

 

 

圖1、GLS先證者的基因分型

 

生化表型

外顯子組結(jié)果提示了GLS缺乏癥，但不是結(jié)論性的，因此研究者進(jìn)行了進(jìn)一步的生化表型分析。淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的功能分析顯示，所有三名患者的GLS活性明顯降低(圖2A)。免疫印跡分析顯示，從所有三名患者獲得的成纖維細(xì)胞中谷氨酰胺酶水平降低，而患者2的淋巴細(xì)胞中實(shí)際上沒有谷氨酰胺酶(圖2B)。重組表達(dá)的突變體GLS顯示出2.8%的殘留酶活性，而重組表達(dá)的p.Tyr308*變體沒有檢測到活性(圖2C)。功能分析方面，穩(wěn)定同位素標(biāo)記的谷氨酰胺、葡萄糖和油酸鹽用于原位分析GLS缺乏癥及其代謝。在從所有三名患者獲得的樣本中，均觀察到與同位素標(biāo)記的谷氨酰胺一起孵育的成纖維細(xì)胞中同位素標(biāo)記的谷氨酸鹽水平顯著降低，這一發(fā)現(xiàn)表明GLS活性是一致的(圖2D)。

 

圖2、GLS缺乏癥的生化特征鑒定

 

基因組測序

生化分析表明患者存在GLS缺乏癥，但是外顯子組測序結(jié)果不能完全從遺傳學(xué)角度進(jìn)行解釋。因此，研究者對患者1的基因組進(jìn)行了測序。對GLS周圍順式調(diào)節(jié)區(qū)的手工分析揭示了在GLS 5’非翻譯區(qū)存在一個(gè)GCA重復(fù)。利用基因組序列擴(kuò)增檢測工具Expansion Hunter，研究者鑒定出一個(gè)染色體上由90多個(gè)GCAs組成的三重復(fù)擴(kuò)增，該擴(kuò)增是先證者從母親遺傳來的。父親遺傳的等位基因有八個(gè)GCA拷貝(圖1A)。

三核苷酸重復(fù)分析

針對STR的GCA重復(fù)區(qū)域，研究者利用重復(fù)引物PCR和GLS重復(fù)PCR進(jìn)行了確認(rèn)。重復(fù)引物PCR檢測，引物與一段GCA重復(fù)序列互補(bǔ)，表明所有三名患者都有較大的GCA重復(fù)擴(kuò)增，他們的一個(gè)或兩個(gè)父母也是如此(圖1B)。使用GCA重復(fù)旁側(cè)引物的重復(fù)PCR反應(yīng)分析顯示，在從三個(gè)先證者獲得的血液樣品中，分別有大約680、900和1500個(gè)重復(fù)的主要擴(kuò)增產(chǎn)物(圖1C)。在家系1、2和3先證者的成纖維細(xì)胞中檢測到少量三核苷酸重復(fù)(400至1100)的擴(kuò)增，這與許多其他重復(fù)擴(kuò)增障礙所報(bào)告的體細(xì)胞異質(zhì)性一致。 

在由8295個(gè)個(gè)體基因組組成的普通人群集合中對該GCA重復(fù)擴(kuò)增位點(diǎn)的分析表明，該短串聯(lián)重復(fù)具有14個(gè)重復(fù)的中值大小(即42 bp)和8個(gè)和16個(gè)重復(fù)的雙峰比率。在所分析的8295個(gè)基因組中，1個(gè)是具有90個(gè)以上重復(fù)的等位基因的雜合子 (圖1D)。

 

重復(fù)介導(dǎo)的效應(yīng)

為了研究與抑制GLS表達(dá)的三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增一致的等位基因表達(dá)不平衡效應(yīng)，研究者對從血細(xì)胞中純化的DNA(三核苷酸重復(fù)擴(kuò)增的上游和下游)進(jìn)行焦磷酸測序，在從任何患者獲得的樣品中沒有發(fā)現(xiàn)DNA甲基化增加的證據(jù)(圖3A)。當(dāng)基因組DNA被甲基化敏感的限制性內(nèi)切酶處理時(shí)，幾乎所有GLS PCR產(chǎn)物的損失證實(shí)了患者成纖維細(xì)胞中甲基化的缺失。

進(jìn)行ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)以確定擴(kuò)增是否影響相鄰GLS啟動子的組蛋白修飾。患者的等位基因檢測顯示組蛋白修飾轉(zhuǎn)錄活性區(qū)(H3乙?；?nbsp;H3K4me3)的修飾水平降低，而一些轉(zhuǎn)錄沉默區(qū)(H3K9me3)的組蛋白修飾得到富集(圖3B)。這種效應(yīng)在攜帶兩個(gè)擴(kuò)增重復(fù)等位基因的患者2中更明顯。這些數(shù)據(jù)表明，重復(fù)擴(kuò)增導(dǎo)致染色質(zhì)構(gòu)型改變，從而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄減少。

為了檢測擴(kuò)增重復(fù)對轉(zhuǎn)錄起始和延伸或翻譯的影響，研究者將含有13個(gè)、104個(gè)和240個(gè)GCA重復(fù)的GLS啟動子的DNA片段克隆到熒光素酶報(bào)告載體中。空白載體(pGL3.1)和含有13個(gè)重復(fù)的載體的比較證實(shí)了，在基線時(shí)和對谷氨酰胺補(bǔ)充的響應(yīng)中強(qiáng)GLS啟動子活性(圖3C)。綜上所述，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明重復(fù)擴(kuò)增的主要作用是改變組蛋白修飾水平，通過促進(jìn)對異染色質(zhì)的形成，減少GLS轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致谷氨酰胺酶缺乏。

 

圖3、重復(fù)介導(dǎo)效應(yīng)機(jī)制

結(jié)論：

1、本研究描述了由三核苷酸STR GCA重復(fù)擴(kuò)增引起的遺傳性代謝缺陷的鑒定。

2、本研究強(qiáng)調(diào)了檢測基因組非編碼區(qū)的重要性。

 

 

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