微生物絕對定量or相對定量,你選對了嗎

發(fā)稿時間：2019-04-15來源：天昊生物

 

前常規(guī)16S擴增子測序在分析樣本間微生物組成時僅考慮微生物的相對豐度（比例），然而相對豐度信息不能反映樣本中微生物物種真實的絕對豐度情況，從而對樣品間菌群的真實變化分析造成嚴重誤判，而且多篇研究文獻已經(jīng)證明只有絕對定量分析才能反映樣本每種微生物的真實數(shù)量和組間樣本的真實差異，因此絕對定量才是微生態(tài)研究的首選。我司于去年下半年推出微生物16S擴增子絕對定量測序技術以來，受到醫(yī)學腸道和環(huán)境微生物領域老師同學們的廣泛歡迎和好評。今天小編就通過一系列實驗數(shù)據(jù)系統(tǒng)展示一下絕對定量VS相對定量的優(yōu)勢！

 

Demo 實 驗 設 計

將9種標準菌株DNA按一定比例混合，標記為標準品DNA。group1：向10ng標準品DNA（微生物DNA占比100%）中添加10ⁿ拷貝外標序列，共3個生物學重復；group2：將標準品DNA與hela細胞基因組DNA按照質量比1:9的比例混合，混合后微生物DNA占比10%，然后向上述10ng DNA（微生物DNA占比100%）中添加和group1相同拷貝數(shù)的外標序列，共3個生物學重復。然后用天昊微生物16S擴增子絕對定量測序技術對上述2組樣品進行檢測，將絕對定量分析（AQ）和相對定量分析（RQ）結果進行對比。

注：上述2組間樣本只是在微生物總量相差10倍，組間樣本同一個菌/總菌的比例完全相同。

 結 果 展 示

Alpha多樣性分析

 

多樣性指數(shù)分析

結論：demo樣本因為是購買的標準菌株混合后的樣本，物種組成較單一（共9種），所有樣本基于相對定量分析（RQ）和絕對定量分析（AQ）得到的群落Observed species均完全一致（都是9種）， shannon和simpson指數(shù)也相似。

注意：現(xiàn)實樣本通過相對定量分析（RQ）得到的Observed species個數(shù)以及shannon和simpson指數(shù)都會比絕對定量分析（AQ）低，原因是抽平使得OTU個數(shù)減少，低豐度OTU的數(shù)據(jù)丟失。 

  

Beta多樣性分析

 

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基于Euclidean（考慮物種有無、絕對豐度）的PCA分析：絕對定量分析（AQ）中Group1和Group2兩組整體菌群組成差異較大，第一象限的差異解釋率達98%，而相對定量分析（RQ）中Group1和Group2兩組組成更為相似。

原因分析：這是因為基于Euclidean距離的PCA分析考慮物種組成和物種絕對豐度情況，group1和group2物種組成相同，所以AQ和RQ分析結果的差異主要取決于兩種分析得到的物種絕對豐度的差異。

 

PCoA分析

基于Bray-Curtis（考慮物種有無、絕對豐度）的PCoA分析：絕對定量分析（AQ）中Group1和Group2兩組整體菌群組成差異較大，第一象限的差異解釋率達99%，而相對定量分析（RQ）中Group1和Group2兩組組成更為相似。

原因分析：這是因為基于Bray-Curtis距離的PCoA分析考慮物種組成和物種絕對豐度情況，group1和group2物種組成相同，所以AQ和RQ分析結果的差異主要取決于兩種分析得到的物種絕對豐度的差異。

 

基于Weighted UniFrac（考慮物種有無、遺傳距離、相對豐度）的PCoA分析：絕對定量分析（AQ）和相對定量分析（RQ）的結果相似。

原因分析：這是因為基于Weighted UniFrac距離的PCoA分析考慮物種組成和物種相對豐度占比情況，group1和group2物種組成相同，而兩種分析得到的物種在樣本中的相對豐度比較一致，所以AQ和RQ分析結果相似。

 

 

群落組成分析

Barplot分析

結論：絕對定量分析（AQ）和相對定量分析（RQ）得到的群落組成結果差異巨大，而絕對定量分析（AQ）結果完全符合理論預期。

原因分析：AQ是以物種真實的絕對拷貝數(shù)為基礎，RQ是以抽平的序列數(shù)為基礎，因為抽平人為將不同樣本間的微生物總量調成一致，掩蓋了樣本間微生物總量的真實差異。 

 

Heatmap分析 

 

結論：絕對定量分析（AQ）和相對定量分析（RQ）得到的熱圖（橫坐標為9種菌，縱坐標為不同組間樣本），結果差異巨大，而絕對定量分析（AQ）結果完全符合理論預期。

原因分析：AQ是以物種真實的絕對拷貝數(shù)為基礎，RQ是以抽平的序列數(shù)為基礎，因為抽平人為將不同樣本間的微生物總量調成一致，掩蓋了樣本間微生物總量的真實差異。 

實驗數(shù)據(jù)總結

 

上述實驗數(shù)據(jù)結果說明如果樣本間微生物總量本身存在差異，使用傳統(tǒng)的相對定量分析會造成錯誤的研究結論，所以，為了得到樣本間細菌群落的真實變化結果，微生態(tài)的研究必須用絕對定量分析替代傳統(tǒng)的相對定量分析。

以上就是天昊16S擴增子絕對定量測序部分更新內容和亮點，當然我們也會繼續(xù)升級有應用價值的分析內容，感興趣的小伙伴們可以關注天昊生物微信公眾號，小編會不定期更新哦。

 

客 戶 合 作 情 況

作為國內唯一一家提供 “微生物16S擴增子絕對定量測序”技術的服務商，我們首先感謝客戶的信任和選擇，僅僅在2018年第四季度，微生物16S擴增子絕對定量測序技術平臺已經(jīng)完成項目數(shù)十個，合作的單位包括中國科學院南京土壤研究所、中國科學院水生生物研究所、廈門大學環(huán)境與生態(tài)學院、中國農(nóng)業(yè)大學、南京農(nóng)業(yè)大學、東北農(nóng)業(yè)大學、重慶市農(nóng)業(yè)科學院、鹽城工學院、南京財經(jīng)大學、南京中醫(yī)藥大學、武漢大學中南醫(yī)院、新疆醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院、山東大學齊魯醫(yī)院等多個單位，覆蓋環(huán)境微生物和腸道微生物等領域。

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