疾病全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析和后續(xù)功能研究最新范例

發(fā)稿時(shí)間：2019-04-03來(lái)源：天昊生物

 

1、Endometriosis-related ceRNA network to identify predictive biomarkers of endometrial receptivity

題目：子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)ceRNA網(wǎng)絡(luò)用于識(shí)別子宮內(nèi)膜容受性的生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)

發(fā)表雜志：Epigenomics 影響因子：4.979  發(fā)表日期：2019-2

 

研究背景

子宮內(nèi)膜異位癥影響大約5-15%的育齡婦女，是一種良性婦科疾病，它與骨盆疼痛和不孕有關(guān)。因此，從研究胚胎植入失敗的機(jī)制中獲得的知識(shí)可能有助于制定具體的治療措施，優(yōu)化胚胎植入。特別是，子宮內(nèi)膜異位癥患者在位子宮內(nèi)膜在著床期間分子差異的發(fā)現(xiàn)代表著了解這種情況的發(fā)病機(jī)制以及開(kāi)發(fā)治療子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)子宮內(nèi)膜容受性缺陷的新策略的重要一步。據(jù)報(bào)道lncRNAs的失調(diào)可能會(huì)影響子宮內(nèi)膜容受性。

ceRNA理論提出極大地?cái)U(kuò)展了人類基因組中的功能性遺傳信息，在病理狀況中發(fā)揮了重要作用。本研究的目的是構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的lncRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，探索可能作為子宮內(nèi)膜容受性生物標(biāo)志物的關(guān)鍵RNA。

研究方法

組織收集

共有16名女性不孕患者參加了這項(xiàng)研究。子宮內(nèi)膜活檢取自手術(shù)和組織學(xué)證實(shí)的子宮內(nèi)膜異位癥患者(n=8)和手術(shù)中發(fā)現(xiàn)無(wú)子宮內(nèi)膜異位癥的患者(n=8)。

實(shí)驗(yàn)分析方法

RNA isolation and RNA-Seq analysis、immunohistochemistry、differentially expressed genes screening、ceRNA network analysis & construction、pathway analysis、topological analysis、key genes and key lncRNA–miRNA–mRNA subnetwork selection、bidirectional clustering。

研究結(jié)果

 

圖1、本研究技術(shù)路線圖

 

免疫組織化學(xué)

通過(guò)免疫組織化學(xué)判斷，ERα、PR-B和PR-A/B的表達(dá)模式在正常組和子宮內(nèi)膜異位癥組之間發(fā)生了變化。根據(jù)IRS測(cè)定，子宮內(nèi)膜異位癥患者在PR-A/B和PR-B受體方面表現(xiàn)出較低水平的上皮子宮內(nèi)膜表達(dá)。

子宮內(nèi)膜異位癥患者全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析

與子宮內(nèi)膜異位癥組相比，正常組共檢測(cè)到767個(gè)mRNAs (181個(gè)上調(diào)和586個(gè)下調(diào))、231個(gè)mRNAs (99個(gè)上調(diào)和132個(gè)下調(diào))和45個(gè)mRNAs (11個(gè)上調(diào)和34個(gè)下調(diào))?；鹕綀D和散點(diǎn)圖顯示了兩組之間lncRNA、mRNA和miRNA表達(dá)的變化。

 

圖2、火山圖顯示了正常人和患者間lncRNA、mRNA和miRNA差異表達(dá)情況

 

LncRNA–miRNA–mRNA關(guān)聯(lián)分析

為了預(yù)測(cè)lncRNAs作為miRNA靶的功能，重構(gòu)了lncRNAs、miRNAs和mRNAs之間的網(wǎng)絡(luò)，然后可視化。LncRNA–miRNA–mRNA網(wǎng)絡(luò)由155個(gè)lncRNA節(jié)點(diǎn)、132個(gè)mRNA節(jié)點(diǎn)、40個(gè)miRNA節(jié)點(diǎn)和463個(gè)邊緣組成。

通路分析

對(duì)上述ceRNA網(wǎng)絡(luò)中的DELs、DEMs和DEMs進(jìn)行GO分類和KEGG途徑的富集分析，以推測(cè)差異表達(dá)RNA類型的潛在功能。GO分子功能分析確定了41個(gè)富集的GO項(xiàng)。KEGG通路、分析的結(jié)果表明，這些基因可能參與了 “氧化應(yīng)激”、“L1和錨蛋白之間的相互作用”、“視黃醇代謝”和“藥物代謝”途徑等。

拓?fù)浞治雠c關(guān)鍵基因的選擇

在通過(guò)DELs、DEMs和DEMs的拓?fù)浞治鰜?lái)識(shí)別ceRNA網(wǎng)絡(luò)的中心節(jié)點(diǎn)的前25個(gè)基因中，重疊基因被選為ceRNA進(jìn)一步分析的關(guān)鍵基因?；诓町惐磉_(dá)RNA的倍數(shù)變化，分層聚類分析揭示了正常組與子宮內(nèi)膜異位癥組樣本RNA表達(dá)的概況。

研究者使用12個(gè)關(guān)鍵RNA構(gòu)建了ceRNA子網(wǎng)。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)與子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的關(guān)鍵差異表達(dá)mRNAs與GO分析中的38條路徑和KEGG分析中的30條路徑相關(guān)，包括“蛻膜化”、“VEGF信號(hào)通路”、“TNF信號(hào)通路”和“卵巢類固醇生成”。

 

圖3、CeRNA子網(wǎng)12個(gè)基因情況。子網(wǎng)包括30個(gè)mRNAs (藍(lán)色節(jié)點(diǎn))、26個(gè)mRNAs (綠色節(jié)點(diǎn))和32個(gè)mRNAs (紅色節(jié)點(diǎn))。虛線強(qiáng)調(diào)了可能在子宮內(nèi)膜容受性中起作用的注釋。

 

lncRNAs–mRNAs–miRNAs的共表達(dá)與功能預(yù)測(cè)

通過(guò)皮爾遜相關(guān)分析進(jìn)一步選擇了ceRNA子網(wǎng)中包含的lncRNAs、miRNAs和mRNAs用于雙向聚類，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)共表達(dá)模塊，包括模塊1的12個(gè)mRNA和模塊2的18個(gè)mRNAs。

 

圖4、模塊1(A)和模塊2(B)的lncRNA–mRNA/miRNA–mRNA共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)

研究結(jié)論

在這里，研究者對(duì)子宮內(nèi)膜異位癥患者子宮內(nèi)膜容受性受損者進(jìn)行了全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，探討了lncRNA在調(diào)節(jié)子宮內(nèi)膜容受性中的作用以及ceRNA機(jī)制的功能，構(gòu)建了一個(gè)子宮內(nèi)膜異位癥相關(guān)的lncRNA-mRNA-miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，探索可以作為指示子宮內(nèi)膜容受性的生物標(biāo)志物的關(guān)鍵RNA。

 

2、lncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF axis is involved in regulating highglucose induced calcification/senescence of VSMCs

題目：lncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF軸參與調(diào)節(jié)高糖誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化/衰老

發(fā)表雜志：Aging 影響因子：4.867  發(fā)表日期：2019-1

 

 

 

研究背景

血管老化在糖尿病患者中非常常見(jiàn)，它可以影響心血管疾病的閾值、進(jìn)展、嚴(yán)重程度和預(yù)后。血管鈣化也是血管老化的一個(gè)重要表型，是糖尿病患者大血管并發(fā)癥的常見(jiàn)影響之一。然而，很少有報(bào)道研究高糖對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化/衰老的影響。此外，高糖誘導(dǎo)VSMC鈣化/衰老的機(jī)制仍不清楚。

研究方法

qRT-PCR、RNA interference、western blot analysis、luciferase reporter assay、RNA pull-down assay、RNA immunoprecipitation (RIP) assay。

 

研究結(jié)果

研究者發(fā)現(xiàn)在高糖誘導(dǎo)的HA-VSMCs鈣化/衰老過(guò)程中，miR-34c-5p的表達(dá)降低

為了證明miR-34c-5p是否參與調(diào)節(jié)HA-VSMCs的鈣化/衰老，分別使用增益和喪失功能的方法來(lái)過(guò)度表達(dá)或抑制miR-34c-5p的表達(dá)。MiR-34c-5p模擬物和抑制劑被轉(zhuǎn)染到HA-VSMCs中，以過(guò)度表達(dá)或抑制miR-34c-5p的表達(dá)。qRT-PCR結(jié)果顯示miR-34c-5p模擬物誘導(dǎo)miR-34c-5p水平增加約50倍，miR-34c-5p抑制劑顯著降低miR-34c-5p的表達(dá)，這些數(shù)據(jù)表明miR-34c-5p在HA-VSMCs的鈣化/衰老過(guò)程中起著負(fù)面作用。

 

lncRNA-ES3通過(guò)直接相互作用抑制miR-34c-5p的表達(dá)

生物信息學(xué)分析顯示miR-34c-5p和lncRNA-ES3之間存在一些互補(bǔ)位點(diǎn)。此外，qRT-PCR證實(shí)了用HG處理的HA-VSMCs中l(wèi)ncRNA-ES3的水平顯著升高。研究進(jìn)一步探索miR- 34c-5p是否可以直接與lncRNA-ES3相互作用。通過(guò)Pull-down等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR-34c-5p序列可以與lncRNA-ES3高度結(jié)合。結(jié)果表明，lncRNA-ES3和miR-34c-5p可以在HA-VSMCs中相互結(jié)合。

 

BMF是miR-34c-5p的目標(biāo)

生物信息學(xué)分析顯示，預(yù)測(cè)BMF的3’UTR區(qū)域包含miR-34c-5p的一些潛在結(jié)合位點(diǎn)。在培養(yǎng)的HA-VSMCs中，miR-34c-5p的過(guò)度表達(dá)顯著降低了BMF的mRNA和蛋白水平，而miR-34c-5p抑制劑它們則顯著增加。熒光素酶測(cè)定表明miR-34c-5p的強(qiáng)表達(dá)顯著抑制WT-BMF報(bào)告者的熒光素酶活性，而在miR-34c-5p過(guò)度表達(dá)后，Mut-BMF報(bào)告者的熒光素酶活性沒(méi)有觀察到變化。Western印跡進(jìn)一步顯示，lncRNA-ES3的沉默能迅速抑制BMF表達(dá)。收集起來(lái)，這些數(shù)據(jù)表明BMF是miR-34c-5p的目標(biāo)，lncRAN-ES3充當(dāng)miR-34c-5p的ceRNA，調(diào)節(jié)HA-VSMCs中目標(biāo)基因BMF的表達(dá)。

 

miR-34c-5p抑制HA- VSMCs的鈣化/衰老，而lncRNA-ES3和BMF促進(jìn)HA-VSMCs的鈣化/衰老

為了探討miR-34c-5p在HA-VSMCs鈣化/衰老中的生物學(xué)作用，本文發(fā)現(xiàn)miR-34c-5p的過(guò)度表達(dá)減弱了HG誘導(dǎo)的HA-VSMCs鈣化，ALP活性、OC分泌、Runx2表達(dá)和礦化結(jié)節(jié)的形成。與此同時(shí)，p16和p21表達(dá)減少，SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞染色，證實(shí)用miR-34c-5p模擬物轉(zhuǎn)染的HA-VSMCs的衰老也明顯減輕。為了評(píng)價(jià)lncRNA-ES3和BMF對(duì)HA-VSMCs鈣化/衰老的影響，分別用sLNcRNA - ES3和siBMF抑制了lncRNA-ES3和BMF在HA-VSMCs中的表達(dá)。結(jié)果表明，lncRNA-ES3或BMF的沉默顯著減弱了高葡萄糖刺激的HA-VSMCs鈣化/衰老，這一點(diǎn)通過(guò)ALP活性、OC分泌、Runx2、p16和p21表達(dá)的降低、礦物質(zhì)化結(jié)節(jié)以及SA-β-gal陽(yáng)性細(xì)胞的染色得到證實(shí)。綜上所述，這些結(jié)果表明miR-34c-5p下調(diào)與HA-VSMCs的鈣化/衰老有關(guān)，這一機(jī)制可能是由高糖誘導(dǎo)的HA-VSMCs中的lncRNA- ES3和BMF介導(dǎo)的。

 

圖5、miR-34c-5p抑制了HA-VSMCs的鈣化/衰老，而lncRNA-ES3和BMF促進(jìn)了HA-VSMCs的鈣化/衰老。

 

研究結(jié)論：

在本研究中，研究者發(fā)現(xiàn)BMF是miR-34c-5p的靶基因，lncRNA-ES3也有miR-34c-5p的一些互補(bǔ)位點(diǎn)。通過(guò)探索lncRNA-ES3/miR-34c-5p/BMF在血管平滑肌細(xì)胞鈣化/衰老中的潛在作用和分子機(jī)制，為尿病血管衰老的潛在治療尋找靶點(diǎn)。

 

 

全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)優(yōu)勢(shì)：

• rRNA去除建庫(kù)，保留了完整的RNA種類信息；
• 鏈特異性文庫(kù)，可以保留轉(zhuǎn)錄本的鏈信息，更準(zhǔn)確地檢測(cè)反義RNA；
• 使用高通量測(cè)序，能夠獲得更加全面的RNA信息，包括低豐度的RNA；
• 通過(guò)測(cè)定的序列信息精確地分析不同類型RNA的表達(dá)豐度變化及其生物學(xué)功能；
• 分析同一樣本中的mRNA、lncRNA、miRNA和circRNA四種類型RNA，明確這些RNA之間的共表達(dá)和調(diào)控關(guān)系，揭示ceRNA調(diào)控機(jī)制。

 

關(guān)于天昊：

天昊生物具有豐富的轉(zhuǎn)錄組和全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序經(jīng)驗(yàn)，我們致力于為研究者提供高質(zhì)量的科研策略咨詢、實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)和遺傳數(shù)據(jù)分析服務(wù)，期待成為大家科研工作中的“昊”助手與“昊”伙伴。歡迎聯(lián)系我們具體咨詢！郵箱：[email protected] 電話：400-065-6886