天昊項(xiàng)目新文：在還原性土壤除害過程中瘤胃球菌科，毛螺菌科和梭菌科是優(yōu)勢菌群

發(fā)稿時(shí)間：2019-04-01來源：天昊生物

南京師范大學(xué)地理科學(xué)學(xué)院近期在《Applied Soil Ecology》上發(fā)表了在還原性土壤除害過程中瘤胃球菌科，毛螺菌科和梭菌科是優(yōu)勢菌群的文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的擴(kuò)增子測序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目：The families Ruminococcaceae, Lachnospiraceae, and Clostridiaceae are the dominant bacterial groups during reductive soil disinfestation with incorporated plant residues

中文題目：在還原性土壤除害過程中瘤胃球菌科，毛螺菌科和梭菌科是優(yōu)勢菌群

期刊名：Applied Soil Ecology   

影響因子：2.916

研究概要：

還原性土壤除害（RSD），又稱生物性土壤除害或厭氧性土壤除害，是一種控制土壤傳播疾病的環(huán)境友好型方法。微生物被認(rèn)為是RSD的關(guān)鍵因素，這對于理解RSD的機(jī)制是至關(guān)重要的，然而關(guān)于這些重要微生物的信息有限。本研究在盆栽試驗(yàn)中對4種土壤進(jìn)行了RSD處理，利用16S rDNA擴(kuò)增子測序檢測了RSD過程中存在的細(xì)菌群落。結(jié)果表明，RSD顯著改變了土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，降低了細(xì)菌的豐富度和多樣性。厚壁菌門相對豐度顯著增加，放線菌門和酸桿菌門相對豐度降低。屬于厚壁菌門的瘤胃球菌科，毛螺菌科和梭菌科是土壤RSD過程中的三大優(yōu)勢菌科。瘤胃球菌科和毛螺菌科，而不是梭菌科與RSD期間的pH下降密切相關(guān)，這被認(rèn)為是短鏈脂肪酸積累的一個(gè)指標(biāo)。除這些細(xì)菌群外，在RSD處理過的土壤中，芽孢桿菌目、細(xì)菌科、伯克氏菌目和擬桿菌目也很豐富。綜上所述，RSD處理、土壤類型及其相互作用共同影響了RSD處理土壤中的細(xì)菌群落組成。

研究背景:

由特定病原體引起的土傳植物疾病已成為一個(gè)全球性的問題，嚴(yán)重威脅農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展。以前，農(nóng)民使用化學(xué)殺蟲劑，來殺死土壤傳播的致病微生物。然而，由于人們越來越擔(dān)心食品安全和環(huán)境污染，這些化學(xué)農(nóng)藥的使用正逐漸受到限制。因此，許多研究人員正在尋找管理土傳病原體的替代方法。2000年，日本和荷蘭分別開發(fā)了還原性土壤除害（RSD），也稱為生物土壤除害或厭氧土壤除害，作為化學(xué)土壤除害的潛在替代品。RSD的概念是提供不穩(wěn)定的有機(jī)基質(zhì)，在被塑料薄膜覆蓋的潮濕土壤中刺激微生物驅(qū)動(dòng)的厭氧土壤條件。該方法已被證明對多種土壤傳播的病原菌有效，如鐮刀菌、青枯菌、大麗輪枝菌、腐霉、黃連白絹病菌和疫霉，以及非同源性線蟲和短體線蟲。然而，RSD的確切機(jī)制尚不清楚。普遍認(rèn)為，土壤微生物群落在RSD過程中發(fā)生了顯著變化，優(yōu)勢微生物在RSD機(jī)制中起著重要作用。這些微生物要么由一些拮抗劑組成，要么產(chǎn)生拮抗化合物，如乙酸、丁酸、Fe²⁺和Mn²⁺，從而從土壤中清除病原體。由于大多數(shù)真菌生長在有氧條件下，在RSD過程中的功能微生物通常是細(xì)菌，其中許多是厭氧菌或兼性厭氧菌。然而，只有少數(shù)研究對RSD過程中的優(yōu)勢菌進(jìn)行了研究。在這些研究中，使用基于16S rRNA基因序列的變性梯度凝膠電泳和克隆文庫分析顯示，梭菌屬、氧桿菌屬和芽孢桿菌屬是RSD處理土壤中最優(yōu)勢的細(xì)菌。然而，由于土壤的多樣性和復(fù)雜性以及添加的有機(jī)質(zhì)，在不同的土壤中利用不同的有機(jī)質(zhì)進(jìn)行RSD可能會(huì)導(dǎo)致不同細(xì)菌群的優(yōu)勢。我們?nèi)匀徊淮_定是否有其它優(yōu)勢細(xì)菌可能出現(xiàn)在不同的RSD處理土壤。本研究以4種致病性農(nóng)業(yè)土壤為研究對象，采用MiSeq測序方法，對未處理和RSD處理土壤中的細(xì)菌群落進(jìn)行了比較，并對RSD處理過程中的優(yōu)勢菌群進(jìn)行了研究。

研究對象：

土壤和有機(jī)基質(zhì)

本研究中使用的四種土壤（JF、BG、HX和NT）如表1所示。由于連續(xù)單季種植，這些土壤嚴(yán)重感染土壤傳播的病原體（表1）。土壤從4個(gè)農(nóng)業(yè)地點(diǎn)采集，深度在3-20厘米之間，每種土壤樣品被徹底混合，用于孵化試驗(yàn)。玉米秸稈和苜蓿曬干，切碎，作為有機(jī)基質(zhì)進(jìn)行RSD處理。玉米秸稈和苜蓿中的總有機(jī)碳和氮分別為428.7 g kg^-1和7.49 g kg^-1和399.1 g kg^-1和13.5 g kg^-1。

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

對每種土壤進(jìn)行對照（CK）和RSD兩種處理。表1描述了四種土壤的RSD處理,加入玉米秸稈和苜蓿等有機(jī)基質(zhì)（1%，w/w）后，將土壤（100克裝在圓柱形容器中；直徑5厘米；高度8厘米）灌至飽和,并用兩層塑料膜（聚乙烯，透明，厚度0.1mm，透氧性低）密封,然后將土壤在30°C下培養(yǎng)15天。CK處理的土壤沒有用有機(jī)基質(zhì)(玉米秸稈和苜蓿)進(jìn)行改良，也沒有密封，在培養(yǎng)過程中其含水量保持在14-18%。每種處理分三次進(jìn)行。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，經(jīng)RSD處理的土壤的氧化還原電位（eh）在?23.7 mV到?87.5 mV之間，表明達(dá)到了降低的條件。然后，立即采集土壤樣本，并進(jìn)行DNA提取。

表1本研究中使用的四種土壤和處理方法的說明

MiSeq測序：細(xì)菌測序區(qū)段（V4）；

研究結(jié)果：

細(xì)菌群落的豐富性和多樣性

雙向方差分析表明，RSD處理、土壤類型及其相互作用對細(xì)菌多樣性有顯著影響。NT土壤中細(xì)菌ACE和香農(nóng)指數(shù)明顯高于其他土壤。單因素方差分析表明，與對照土壤相比，RSD處理后的JF和BG土壤細(xì)菌ACE指數(shù)顯著降低。相比之下，RSD處理的HX和NT土壤中的細(xì)菌ACE指數(shù)沒有顯著差異。RSD處理的JF和NT土的香農(nóng)指數(shù)顯著低于相應(yīng)的CK土壤。與相應(yīng)的CK土壤相比，RSD處理的BG和HX土壤的香農(nóng)指數(shù)略有下降，但不顯著（圖1）。

圖1土壤細(xì)菌群落指數(shù)ACE和Shannon

與對照組相比，RSD處理土壤中的特異OTU更少。在RSD處理的JF、BG、HX和NT土壤中，特異OTU分別占總OTU的80.2%、48.2%、46.6%和66.6%（圖2）。

圖2 對照（CK）土壤和還原性土壤除害（RSD）處理土壤中共享和特異的OTUs。

細(xì)菌群落的PCA

采用主成分分析法（PCA）對RSD處理和對照土壤樣品中細(xì)菌群落的異同進(jìn)行了評價(jià)。RSD處理和未處理的CK土壤樣品之間存在著主要的差異，而不是不同土壤類型之間的差異。PERMANOVA進(jìn)一步證實(shí)，RSD處理、土壤類型及其相互作用對細(xì)菌群落有顯著影響（P<0.001），三個(gè)因子中的r²分別為0.47、0.30和0.15。此外，在RSD處理過的土壤樣本中，厚壁菌門Firmicutes是最重要的分布決定因素，其次是Actinobacteria, Chloroflexi, Acidobacteria, Planctomycetes, Gemmatimonadetes（圖3）。

圖3 還原性土壤除害（RSD）處理（紅色）和對照（CK）（黑色）土壤樣品細(xì)菌群落的主成分分析

土壤中的優(yōu)勢菌群

在多個(gè)分類水平上，細(xì)菌組成顯著受RSD處理、土壤類型及其相互作用的影響。在門水平上，RSD處理后的JF、BG、HX和NT土壤中厚壁菌門的相對豐度比相應(yīng)CK土壤高3.92、11.32、3.00和25.57倍。在不同土壤中，JF土壤中厚壁菌門的相對豐度最高。另外，與相應(yīng)對照土壤相比，RSD處理土壤中放線菌門和酸桿菌門的相對豐度也顯著降低（圖4）。

圖4 對照（CK）和還原性土壤除害（RSD）處理土壤中細(xì)菌門的相對豐度

在目水平上，梭菌目屬于厚壁菌門，是主要的細(xì)菌目，在RSD處理的JF、BG、HX和NT土壤中，其相對豐度顯著增加了62.9%、28.4%、10.6%和35.1%。在不同土壤中，JF土壤中梭菌目相對豐度最高。相比之下，在RSD處理的JF和HX土壤中相對豐度降低的主要細(xì)菌目是放線菌目，在RSD處理的BG和NT土壤中相對豐度降低的主要細(xì)菌目是酸桿菌目和噬纖維菌目（圖5）。

圖5 與對照土壤相比，還原性土壤除害（RSD）處理的JF、BG、HX和NT土壤中細(xì)菌數(shù)量相對增加和減少

在科水平上，經(jīng)RSD處理的JF、BG和HX土壤中的瘤胃球菌科和梭狀芽孢桿菌科顯著增加，在RSD處理的JF和HX土壤中，毛螺菌科顯著增加。除了RSD處理土壤中富集的常見菌科外，每種土壤類型中也富集了一些特異的細(xì)菌科，如JF中的鞘氨醇桿菌科和腸桿菌科；BG中的桿菌科和擬桿菌科中的非分類細(xì)菌；HX中的黃單胞菌科和類芽孢桿菌科；NT中的消化鏈球菌科、Ignavibacteria科和Rhodocyclaceae（圖6）。

圖6 與對照土壤相比，還原性土壤除害（RSD）處理的JF、BG、HX和NT土壤中細(xì)菌科的相對豐度增加和減少

土壤pH，除害效率和優(yōu)勢菌群的關(guān)系

RSD處理后，四種土壤的土壤pH值變化顯著不同。Pearson’s相關(guān)分析表明，土壤pH變化（由RSD處理引起）與RSD處理土壤中厚壁菌門的相對豐度呈顯著負(fù)相關(guān)，土壤初始pH（與土壤類型相關(guān)）與土壤中酸桿菌和放線菌的相對豐度呈負(fù)相關(guān)。梭菌目（RSD處理土壤中的主要細(xì)菌目，屬于厚壁菌門）的相對豐度與土壤pH變化呈負(fù)相關(guān)，與土壤初始pH呈正相關(guān)。與此相反，放線菌目（放線菌門的主要目）的相對豐度與土壤pH變化呈正相關(guān)，與土壤初始pH呈負(fù)相關(guān)。作為梭菌目的兩個(gè)主要科，瘤胃球菌科和毛螺菌科的相對豐度與土壤初始pH呈正相關(guān)，與土壤pH變化呈負(fù)相關(guān)，而梭菌目的另一個(gè)主要科，梭菌科的相對豐度與土壤初始pH以及土壤pH變化不相關(guān)。同樣地，土壤pH與梭菌屬、糞球菌屬和UC瘤胃球菌科的相關(guān)性與梭菌目、毛螺菌科和瘤胃球菌科的相關(guān)性相似。病原菌豐度與厚壁菌門及其科，如梭菌科、瘤胃球菌科、毛螺菌科呈顯著負(fù)相關(guān)，與酸桿菌門、放線菌門、 綠彎菌門、芽單胞菌門和浮霉菌門呈顯著正相關(guān)（表2）。

表2土壤pH、病原菌豐度與優(yōu)勢菌群相對豐度的Pearson’s相關(guān)系數(shù)