天昊項(xiàng)目新文：參與Bt轉(zhuǎn)基因水稻秸稈分解的活性微生物研究

發(fā)稿時(shí)間：2019-03-19來源：天昊生物

南京農(nóng)業(yè)大學(xué)近期在《Applied Microbiology and Biotechnology》上發(fā)表了參與Bt水稻秸稈分解的活性微生物研究的文章。在這項(xiàng)研究中天昊生物有幸承擔(dān)了樣品的擴(kuò)增子測(cè)序工作。在恭喜客戶又發(fā)表文章同時(shí)，我們想跟大家分享一下文章的研究思路。

英文題目： Probing active microbes involved in Bt-containing rice straw decomposition

中文題目：參與Bt水稻秸稈分解的活性微生物研究

期刊名：Applied Microbiology and Biotechnology    

影響因子：3.34

研究概要：

轉(zhuǎn)基因蘇云金芽孢桿菌（Bt）水稻對(duì)害蟲的防護(hù)作用顯著，滿足了日益增長(zhǎng)的食物和能源需求。許多研究已經(jīng)對(duì)Bt水稻對(duì)農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)的影響進(jìn)行了研究，但對(duì)于確定Bt水稻的存在如何影響和塑造微生物群落，特別是活性微生物的研究卻很少。穩(wěn)定同位素探測(cè)和高通量測(cè)序被用于檢測(cè)參與Bt秸稈分解過程中的活性微生物。與近等位線相比，Bt秸稈中總氮、總磷、總鉀、木質(zhì)素、纖維素和Cry1Ab毒素蛋白含量較高，這些化學(xué)差異對(duì)分解速率沒有影響，但對(duì)具有分解活性的微生物菌群落有顯著影響。在Bt秸稈的分解過程中，真菌的影響大于細(xì)菌。壤霉菌屬、地桿菌屬、細(xì)桿菌屬、糖霉菌屬和Kribbella是最具代表性的細(xì)菌屬（僅存在于Bt處理組，并在早期出現(xiàn)）；木霉是Bt秸稈分解過程中最具代表性的獨(dú)特真菌屬。通過相似指數(shù)計(jì)算和功能預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)Bt秸稈和非Bt秸稈處理的微生物類群和功能性狀存在顯著差異，這些結(jié)果表明，在微生物分解秸稈方面，Bt水稻對(duì)土壤微生物具有顯著而短暫的影響。

研究背景：

水稻是世界上主要的糧食作物，對(duì)轉(zhuǎn)基因水稻的開發(fā)已久，在水稻中引入外源基因有可能保持或提高產(chǎn)量，其中一個(gè)途徑是提高水稻對(duì)害蟲的抗性。轉(zhuǎn)基因蘇云金芽孢桿菌（Bt）水稻表達(dá)殺蟲蛋白，最早于1989年開發(fā)，這種轉(zhuǎn)基因水稻顯示出對(duì)害蟲的高度防護(hù)，從而減少了化學(xué)殺蟲劑的使用。然而，Bt水稻所含的Cry蛋白通過Bt水稻殘基和根系分泌物釋放到土壤中，因?yàn)槲⑸锸峭寥郎鷳B(tài)系統(tǒng)的核心，這一現(xiàn)象是否對(duì)土壤微生物群落有著深遠(yuǎn)的影響是至關(guān)重要的，此前已經(jīng)開展了廣泛的研究，以研究Bt作物對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)的各種影響，但對(duì)于Bt水稻的存在如何影響和塑造微生物群落，人們的關(guān)注卻很少。據(jù)報(bào)道，用Bt稻秸和非Bt稻秸對(duì)水稻土進(jìn)行早期改良，可培養(yǎng)的好氧菌、放線菌、真菌、厭氧發(fā)酵菌、反硝化菌、產(chǎn)氫產(chǎn)醋酸菌、產(chǎn)甲烷菌在水稻土中有一些偶然的、顯著的變化。同樣，在稻田根系分解早期，Bt水稻根與非Bt水稻根處理的真菌群落組成也存在顯著差異。然而，一些研究表明，Bt水稻的種植對(duì)土壤微生物群落的影響很小或沒有。以往的研究表明，在植物基因組中引入外源基因可能改變植物殘基的組成，進(jìn)而影響有機(jī)質(zhì)分解和土壤養(yǎng)分循環(huán)。稻草可以直接返回農(nóng)田，也可以在堆肥后作為有機(jī)物返回，以提高土壤肥力。這些常見的農(nóng)業(yè)實(shí)踐將大大增加種植Bt水稻對(duì)土壤微生物的影響，因此，在評(píng)估Bt作物種植影響時(shí)應(yīng)更加關(guān)注Bt秸稈的影響。

積極利用Bt水稻碳資源的微生物不能與那些在土壤中分解遺傳有機(jī)物的微生物區(qū)別開來，甚至在使用常規(guī)方法（總DNA測(cè)序）時(shí)也不能與那些沒有生命的微生物區(qū)別開來。穩(wěn)定同位素探測(cè)（SIP）為鑒定消化特定底物的微生物并分析其在環(huán)境中的作用提供了一種與培養(yǎng)無關(guān)的方法。據(jù)報(bào)道， ¹³C脈沖示蹤結(jié)合磷脂脂肪酸（PLFA）分析表明對(duì)Bt水稻根際微生物群落組成無持續(xù)或不利影響。然而，采用¹³C脈沖追蹤標(biāo)記結(jié)合克隆文庫的研究發(fā)現(xiàn)，Bt水稻根際存在一種修飾過的活性產(chǎn)甲烷古菌群落。對(duì)Bt水稻（甚至其它Bt作物）秸稈分解過程中的活性微生物相關(guān)研究較少。2007年，利用¹³C標(biāo)記植物殘基進(jìn)行了第一次DNA-SIP實(shí)驗(yàn)，研究了小麥殘基的分解過程，采用等密度梯度超離心法從總提取DNA中提取¹³C標(biāo)記的DNA，用于活性微生物的進(jìn)一步分析。隨著高通量測(cè)序技術(shù)的推廣，與傳統(tǒng)的DGGE、T-RFLP等方法相比，可以在更高的分辨率和深度上探索微生物群落。DNA-SIP和高通量測(cè)序相結(jié)合的方法將為研究Bt水稻中的活性微生物提供新的視角。

本研究的目的是在水稻土中加入¹³C標(biāo)記的Bt稻草，并對(duì)其降解過程中的活性細(xì)菌和真菌群落進(jìn)行研究。將¹³C標(biāo)記的Bt稻草與土壤均勻化，培養(yǎng)5周以上。為了更好地分析土壤中吸收¹³C標(biāo)記的Bt稻草中碳的活性微生物動(dòng)態(tài)，通過監(jiān)測(cè)土壤呼吸來校準(zhǔn)采樣時(shí)間點(diǎn)。關(guān)于微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性，采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)秸稈分解過程中活性微生物群落的動(dòng)態(tài)特征進(jìn)行了研究，同時(shí)利用PICRUSt和FUNGuild分別推斷細(xì)菌和真菌的功能。本研究探討了Bt水稻對(duì)微生物類群和功能的影響。為了確定Bt水稻對(duì)土壤微生物群落是否有深遠(yuǎn)影響，本研究的重點(diǎn)關(guān)注兩個(gè)主要問題：（i）Bt水稻與其非轉(zhuǎn)基因親本之間在參與秸稈降解的活性微生物上存在無差異、微小差異或顯著差異？（ii）參與Bt稻草分解的活性微生物是什么？

MiSeq測(cè)序：細(xì)菌測(cè)序區(qū)段（V4-V5）； 真菌測(cè)序區(qū)段（ITS2）

研究結(jié)果：

Bt和非Bt秸稈的性能差異明顯

Bt秸稈總氮、總磷、總鉀、木質(zhì)素和纖維素含量高于非Bt秸稈，僅在Bt秸稈中檢測(cè)到Cry蛋白。本研究中bt和非bt秸稈中半纖維素的含量沒有顯著差異（表1）。

 

活性微生物群落組成在Bt和非Bt處理之間有顯著區(qū)別，并隨時(shí)間推移而變化

考慮到土壤呼吸的趨勢(shì)，添加秸稈后1周、3周和5周分別進(jìn)行3次采樣。WK1（第一周）、WK3（第三周）和WK 5（第五周）分別定義為秸稈分解的早期、中期和后期。Bt處理和非Bt處理下土壤呼吸無顯著性差異。¹³C標(biāo)記菌群的NMDS分析表明Bt和非Bt處理在垂直軸上存在差異，并根據(jù)不同的采樣時(shí)間在水平軸上產(chǎn)生連續(xù)的點(diǎn)（圖1a）。此外，PERMANOVA顯示¹³C標(biāo)記細(xì)菌群落與轉(zhuǎn)基因和時(shí)間有顯著的相關(guān)性。¹³C標(biāo)記的真菌群落的NMDS排序與細(xì)菌群落的NMDS排序相似（圖1b）。在細(xì)菌和真菌群落中，時(shí)間的影響遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于轉(zhuǎn)基因的影響。

 

圖1基于Bray-Curtis相似指數(shù)的活性微生物群的NMDS排序。不同的顏色代表不同的處理和采樣時(shí)間點(diǎn)。A細(xì)菌群落,B真菌群落。

 

Bt和非Bt秸稈分解中的共享和獨(dú)特物種

Bt和非Bt秸稈處理共享部分類群，Streptomyces鏈霉菌是Bt和非Bt秸稈處理中最具優(yōu)勢(shì)和活性的一個(gè)屬（圖2a）。本研究所鑒定的五種鏈霉菌中，有一種（bOTU57）只存在于Bt秸稈處理中，其豐度相對(duì)較低。鏈霉菌的其他種類（bOTU1, bOTU2, bOTU4, bOTU5）在Bt和非Bt秸稈分解過程中均表現(xiàn)出很高的相對(duì)豐度，并存在于各個(gè)時(shí)期。然而，在Bt和非Bt秸稈處理下，這些共有的物種表現(xiàn)不同，它們要么隨時(shí)間逐漸增加或減少，要么只在某一時(shí)期存在，此外它們的相對(duì)豐度在不同的處理中也不同。此外，Xanthomonadales黃單胞菌屬的兩個(gè)溶菌屬（bOTU7 和 bOTU9）、一個(gè)Dyella sp.屬（bOTU12）和一個(gè)紅桿菌屬（bOTU6）以及一個(gè)Massilia屬（bOTU13）表現(xiàn)出與Streptomyces鏈霉菌相似的特性，盡管它們的相對(duì)豐度低于鏈霉菌屬。

Bt秸稈處理具有獨(dú)特的分類群，例如屬于Micrococcales微球菌的5個(gè)物種中有4個(gè)是Bt處理獨(dú)有的：2個(gè)農(nóng)桿菌屬（bOTU19和bOTU28）在整個(gè)培養(yǎng)過程中都存在，而地桿菌屬（bOTU18）和微桿菌屬（bOTU34）只存在于早期。除此之外，早期還存在糖酵母菌屬（bOTU62）和鏈霉菌屬（bOTU57）；早期和中期還存在Kribbella屬（bOTU16）；晚期還存在螯合球菌屬（bOTU24）。

相反一些類群只在非Bt秸稈處理下出現(xiàn)，例如，Vulgatibacter sp. (bOTU39)僅在早期存在。除此之外，Devosia sp. (bOTU44), Altererythrobacter sp. (bOTU31), 四個(gè)未分類群 (bOTU36, bOTU20, bOTU60, bOTU124)僅在中期出現(xiàn)。

 

 

圖2最具活性O(shè)UT聚類分析。不同的氣泡大小代表不同的豐度。優(yōu)勢(shì)共享類群以紅灰色標(biāo)記，Bt秸稈處理獨(dú)特類群以藍(lán)灰色標(biāo)記，非Bt秸稈處理獨(dú)特類群以黃灰色標(biāo)記。標(biāo)記的分類群共享的最高分類分辨率標(biāo)記在氣泡圖的右側(cè)。A細(xì)菌群落。

真菌種類分布較均勻，主要是Ascomycota子囊菌屬和Mucoromycotina粘液菌屬（圖2b）。紫錐菌屬（fOTU 1）是Bt和非Bt秸稈處理最活躍的真菌類群。屬于Aspergillaceae曲霉科的3種Penicillium spp.青霉屬（fOTU13、fOTU25和fOTU54）和3種Aspergillus spp.曲霉屬（fOTU27、fOTU31和fOTU34）也被Bt和非Bt秸稈處理所共有，并且占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位。

與細(xì)菌類群相似，一些真菌類群是Bt秸稈處理的特有類群。在早期階段，出現(xiàn)了Zopfiella sp. (fOTU32)，中期出現(xiàn)了Alternaria sp. (fOTU97)和Neonectria sp. (fOTU105)。值得注意的是，木霉菌Trichoderma sp. (fOTU128)在各個(gè)階段都存在。

相比之下，一些分類群Lichtheimia sp. (fOTU60)和兩個(gè)非分類種(fOTU122 and fOTU623)出現(xiàn)在后期，并且是非bt秸稈特有的。

 

圖2最具活性O(shè)UT聚類分析。不同的氣泡大小代表不同的豐度。優(yōu)勢(shì)共享類群以紅灰色標(biāo)記，Bt秸稈處理獨(dú)特類群以藍(lán)灰色標(biāo)記，非Bt秸稈處理獨(dú)特類群以黃灰色標(biāo)記。標(biāo)記的分類群共享的最高分類分辨率標(biāo)記在氣泡圖的右側(cè)。B真菌群落。

Bt與非Bt秸稈處理后活性群落的相似性指數(shù)在后期有所增加。

所有與秸稈分解有關(guān)的微生物都被定義為labeled標(biāo)記群落（或活性群落）。此外相對(duì)豐度大于1%的標(biāo)記類群被認(rèn)為是abundant豐富群落。根據(jù)Bray-Curtis距離，計(jì)算并比較了不同分解階段Bt和非Bt秸稈處理的labeled標(biāo)記群落（圖3，右）和abundant豐富群落（圖3，左）的相似性指數(shù)。就abundant豐富群落而言，在細(xì)菌群落（圖3a）和真菌群落（圖3b）中Bt和非Bt處理之間的相似性隨時(shí)間而增加；在labeled標(biāo)記群落方面，相似性下降，然后增加。最后，無論是labeled標(biāo)記群落還是abundant豐富群落，Bt和非Bt秸稈處理細(xì)菌群落的相似性總是高于真菌。

 

圖3 Bt和非Bt秸稈處理后活性群落（豐富或標(biāo)記群落）的相似性。A細(xì)菌群落的相似性, B真菌群落的相似性。

Bt和非Bt秸稈處理之間細(xì)菌功能相似但真菌功能不同

通過PICRUSt預(yù)測(cè)細(xì)菌功能，由于本研究的重點(diǎn)是秸稈分解，因此僅考慮與代謝相關(guān)的結(jié)果。無論是轉(zhuǎn)基因還是孵育時(shí)間預(yù)測(cè)結(jié)果都非常相似（圖4a），氨基酸代謝和碳水合物代謝是細(xì)菌最主要的功能。

圖4不同處理過程中活性微生物群落的預(yù)測(cè)功能。A細(xì)菌功能。

用FUNGuild預(yù)測(cè)真菌功能，與細(xì)菌功能不同，Bt和非Bt秸稈處理的真菌功能明顯不同，并隨時(shí)間變化（圖4b）。值得注意的是，Bt和非Bt秸稈處理之間真菌功能的相似性隨著時(shí)間的推移而增加。

 

圖4不同處理過程中活性微生物群落的預(yù)測(cè)功能。B真菌功能。

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