Nature Plants：靶向DNA甲基化抑制擬南芥開花基因座FLOWERING LOCUS T（FT）的增強子

發(fā)稿時間：2019-03-14來源：天昊生物

植物DNA甲基化一直是表觀遺傳學研究的熱點領域。3月4日剛剛發(fā)表在Nature Plants上的文章，就巧妙的利用了反向重復序列（IR）轉基因的方法，定向提高了目標區(qū)域DNA甲基化水平，達到了調控下游基因表達的目的，為表觀調控研究提供了新的思路和方法。

FLOWERING LOCUS T（FT）在長日照下調控擬南芥開花過程中起著重要作用。FT在葉片中的表達取決于轉錄起始位點(TSS)上游5 kb遠端轉錄增強子Block C。研究人員表達Block C的反向重復序列（IR）來誘導局部DNA甲基化和異染色質形成，導致誘導光周期中FT表達下調。利用靶向DNA甲基化作為工具來研究FT基因座的未知調控區(qū)域，研究者將位于基因下游1?kb的Block E鑒定為FT的新增強子。分析發(fā)現(xiàn)Block C和Block E在十字花科中是保守的，位于可接近的染色質中，充當加性轉錄增強子。其與近端FT啟動子結合，控制FT表達來完成對光周期的響應。

轉錄增強子是多種轉錄因子的結合平臺。增強子被證明與目標基因的啟動子有物理上的相互作用，在那里它們參與轉錄因子等的招募。到目前為止，與動物中的增強子相比，植物中的增強子相對較少。

在植物中，從頭合成的DNA甲基化是通過RNA依賴的DNA甲基化(RdDM)途徑建立的。根據(jù)該機制，利用反向重復序列(IR)表達產(chǎn)生的雙鏈RNA，被直接加工進入RdDM途徑，從而對特定區(qū)域進行靶向DNA甲基化，這提供了一種通過轉錄基因沉默(TGS)來改變基因活性的方法。在擬南芥中，IR介導的TMM和FT啟動子的DNA甲基化誘導了TGS。在這里，本研究了證明IR介導的DNA甲基化可以抑制遠端調控區(qū)的活性，使人們能夠發(fā)現(xiàn)新的調控區(qū)，并研究它們在天然基因組環(huán)境中對基因表達的影響。

實驗方法

目標區(qū)域DNA甲基化克隆測序、ChIP-qPCR、小RNA測序、GUS組織化學染色等。

實驗結果

IR誘導轉基因植株晚花

在哥倫比亞(Col-0)野生型擬南芥背景(WT)中產(chǎn)生表達Block C IR靶向Block C處DNA甲基化，并評估轉基因株系對FT表達的影響 (圖1a，b)。在強FT誘導的長日照(16?h light/8?h黑暗)和中等誘導的日照條件(12?h light/12?h黑暗)下，評估每一代的開花時間。為了比較不同世代的開花時間，在等日照條件下，每一個株系同時生長四代( T3至T6)。與野生型相比，轉基因株系的開花明顯延遲，而非轉基因株系的開花略有延遲(圖1c)。在長日照條件下，檢測了T3代和T6代的四個株系的FT表達及對應于它們各自的開花表型。轉基因株系no.15-2和no.27-4的FT表達顯著降低，而非轉基因株系no.15-3和no.27-3并沒有 (圖1e)，說明IR靶向Block C的存在與誘導光周期的延遲開花和FT表達減少明顯相關。

圖1、Block C IR轉基因植物出現(xiàn)花期延遲和FT表達下調現(xiàn)象

DNA甲基化和異染色質形成在Block C被誘導

先前的研究表明，DNA甲基化介導的TGS需要24-nt的小RNA(smRNA)。IR的表達產(chǎn)生dsRNA，其可由DICER LIKE 3 (DCL3)處理后整合進入RdDM路徑。研究者在T6代對轉基因和非轉基因株系的smRNAs進行測序，發(fā)現(xiàn)smRNAs僅在轉基因株系中特異性地定位到IR靶向區(qū)域。因此，產(chǎn)生smRNA需要IR的存在，這僅限于IR莖環(huán)的內(nèi)部400bp (圖2a)。定位到的IR目標區(qū)域主要為21-nt長smRNA，接著是22-nt和24-nt smRNA(圖2b)。轉基因株系no.27-4產(chǎn)生的smRNAs是株系no.15-2的大約7倍，但是FT表達的減少在這兩個株系中是相當?shù)?，表明該途徑?/span>smRNAs是飽和的(圖2a，b)。

研究者之后用亞硫酸氫鹽處理來檢測Block C的DNA甲基化水平，證實了之前報道的Col-0野生型幼苗中Block C不存在DNA甲基化(圖2c)。在轉基因株系中，DNA甲基化在包括Block C的IR靶區(qū)被誘導。利用DNA甲基化克隆測序（至少10個克隆/位置）的方法，檢測了單胞嘧啶位置上DNA甲基化水平從10%到100%不等(圖2c)。DNA甲基化也在IR靶區(qū)兩側100?bp檢測到，盡管沒有smRNAs定位到這些區(qū)域(圖2c)。為了評估DNA甲基化的擴散范圍，選擇位于Block C和FT TSS之間的300bp區(qū)域作為對照。在對照區(qū)沒有觀察到DNA甲基化，表明DNA甲基化沒有從Block C向FT的TSS擴散。之后比較了T3代和T5代的DNA甲基化水平，發(fā)現(xiàn)CG甲基化在兩個轉基因株系中得以維持，在非轉基因株系中維持的程度要低得多，no.15-3株系為約10 %，no.27-3株系極少。在沒有轉基因的情況下CG甲基化從T3代維持到T5代(圖2d)。CHH甲基化在轉基因株系中隨著世代的進展而降低，而在非轉基因株系no.15-3和no.27-3中幾乎為零(圖2d)?？偟膩碚f，這些結果表明，IR丟失時，CG甲基化得到部分維持，維持水平因株系而異。

甲基化的DNA可以招募組蛋白甲基轉移酶KYP，這將組蛋白H3的賴氨酸K9二甲基化(H3K9me2)，導致染色質致密化。H3K9me2反過來又分別招募環(huán)境中的CMT2和CMT3來促進CHH和CHG的DNA甲基化。本研究使用染色質免疫沉淀(ChIP)檢測了IR誘導的DNA甲基化是否導致H3K9me2在Block C沉積。在兩個獨立的實驗中，與野生型相比，轉基因株系中H3K9me2水平增加，而非轉基因no.15-3株系沒有觀察到增加(圖2e)。

圖2、在含有IR轉基因植物中Block C區(qū)域 DNA被甲基化

FT由下游增強子Block E調節(jié)

由于IR靶向Block C造成其DNA甲基化，進而下調了FT表達，本實驗用這種方法檢測了可能參與FT表達的其他區(qū)域(圖3a )。研究者為先前識別的Block B和一個被描述為Col-0插入?yún)^(qū)域設計了IRs，該區(qū)域存在于大約25 %的擬南芥材料中(圖3a)?；谇叭?/span>3C數(shù)據(jù)，這些區(qū)域對應于顯示與近側FT啟動子相互作用的兩個不同區(qū)域。DNA甲基化以前在Block B沒有報道過，而Col-0插入顯示帶有甲基化。IRs的表達誘導Block B的DNA甲基化，導致Col-0插入處CHG和CHH的甲基化增加 (圖3b)。盡管對于表達IR靶向Col-0插入?yún)^(qū)的植物，檢測到FT表達沒有統(tǒng)計學上的顯著差異(圖3c)，但檢測到輕度但顯著的后期開花表型(圖3d)。

通過系統(tǒng)發(fā)育分析，通過分析更多十字花科物種的直系同源序列。位于FT下游1?kb的600?bp位置，命名為Block E，在所有序列中高度保守(圖3a)。除了系統(tǒng)發(fā)育外，Block E和Block C都位于極易接近的染色質上(圖3a)。進一步的分析顯示，Block E和Block C共享幾個與潛在TFBSs重疊的超保守區(qū)域，例如一個I盒、一個RE-alpha盒和兩個CCAAT盒。此外，區(qū)塊包含G盒( CACGTG)， ChIP-seq數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)其與光敏色素相互作用因子4 (PIF4)的結合峰。

研究者設計了一個IR來靶向Block E，并測試DNA甲基化積累是否會像Block C一樣影響開花時間(圖3a)。與野生型相比，Block E IR的表達統(tǒng)計上顯著延遲了開花時間(圖3e)。與開花時間的延遲一致，在表達針對Block E的IR的轉基因系中，FT表達減少(圖3f)，這與所有序列DNA甲基化的增加(圖3b)相關。

為了研究兩個遠端調控區(qū)之間的遺傳作用關系，研究者檢測了IRs Block E和Block C間F1雜交的開花時間，F1植株開花的時間明顯晚于親本?？偟膩碚f，這兩個調控區(qū)域在調節(jié)開花時間方面起著加性作用(圖3g)。

圖3 、Block E是位于FT下游的一個新的調控元件

Block E和Block C增強了FT啟動子的光周期編碼響應

考慮到Block E和Block C共有的TFBSs數(shù)量，研究者檢測了Block E穩(wěn)定轉化報告基因株系中的順式調節(jié)功能。之前報道表明，與Block A融合的Block C，而不是單獨的Block A，可以使葉片中GUS的表達。Block E正向和反向融合到FT區(qū)(Block A)或NOS啟動子上。盡管Block C顯示僅當與Block A融合時驅動GUS表達，框Block E能夠用兩種最小啟動子驅動GUS表達(圖4a)。

為了評估阻斷Block E在對光周期的反應中是否調節(jié)了表達，實驗比較了在短時間內(nèi)連續(xù)生長的3?周幼苗和2天轉換到長時間后的幼苗之間的報告基因表達。我們只使用了反向方向的Block E的結構植株，因為這些植株給出了最強的信號。通過對樣品進行GUS轉錄的qRT-PCR分析。結果顯示在長時間條件下，包含與Block A的融合的Block C或Block E有明顯的誘導作用，而與minNOS的融合沒有反應(圖4b)。