淺談：論微生物絕對定量VS相對定量的優(yōu)越性

發(fā)稿時間：2019-03-06來源：天昊生物

    

●當(dāng)前常規(guī)細(xì)菌16S擴(kuò)增子測序方法能解析樣本中的物種組成和其相對豐度信息，因此對微生態(tài)研究具有重要的促進(jìn)作用。然而我們需要注意一點，那就是相對豐度并不能反映樣本每種微生物的真實數(shù)量和組間樣本的真實差異，這是為什么呢？這是因為由于常規(guī)細(xì)菌16S擴(kuò)增子測序每個樣本之間對應(yīng)的 reads 數(shù)量差距較大，為避免因樣本數(shù)據(jù)大小不同而造成分析時的偏差，需對每個樣本進(jìn)行隨機(jī)抽平處理，一般選擇測序樣本中最少 reads 數(shù)作為基數(shù)， 即將所有樣本的 reads 數(shù)統(tǒng)一抽平到該值， 因此抽平處理使相對豐度分析忽略了不同樣本之間總體微生物量存在的現(xiàn)實差異，造成了分析結(jié)果的偏差，而絕對定量分析則是計算樣本每種微生物的拷貝數(shù)，從而實現(xiàn)絕對定量，因此絕對定量分析能反映樣本每種微生物的真實數(shù)量和組間樣本的真實差異，因此絕對定量分析相對于相對定量分析更能反映樣本細(xì)菌群落的真實變化，是進(jìn)行微生態(tài)研究的首選，下面小編就拿幾篇研究文章的結(jié)果舉例證明。

 

文章一  微生物絕對定量分析真正將腸道菌群變化與微生物載量聯(lián)系起來

 

英文題目: Quantitative microbiome profiling links gut community variation to microbial load

中文題目：微生物絕對定量分析真正將腸道菌群變化與微生物載量聯(lián)系起來

期刊名：Nature

發(fā)表時間：2017年

支持證據(jù)：

• 為了證明絕對定量數(shù)據(jù)（QMP）在臨床研究中的潛在作用，我們對29例克羅恩病患者和健康人的樣本進(jìn)行絕對定量數(shù)據(jù)分析。流式細(xì)胞儀分析表明，克羅恩病患者糞便樣品中的細(xì)胞數(shù)比健康對照組低3倍（圖4a）。
• 發(fā)現(xiàn)只在應(yīng)用相對數(shù)據(jù)RMP分析時，類桿菌Bacteroides才與克羅恩病相關(guān)（圖4b左），僅在使用絕對定量數(shù)據(jù)QMP時，普雷沃菌屬Prevotella才在克羅恩病患者中發(fā)現(xiàn)顯著降低（圖4b右）。
• 以上這些觀察強(qiáng)調(diào)了相對數(shù)據(jù)（RMP）分析的局限性：來源于相對數(shù)據(jù)（RMP）分析的一個錯誤結(jié)果解釋可能提示類桿菌Bacteroides在克羅恩病的發(fā)病或發(fā)展中的假因果關(guān)系，為什么會出現(xiàn)這種假因果關(guān)系，這是因為相對定量分析忽視了健康對照和克羅恩病患者腸道微生物總豐度的巨大差異（差3倍），通過人為抽平處理認(rèn)為樣本間微生物總豐度一致，從而造成上述錯誤，因此本文認(rèn)為只有絕對定量數(shù)據(jù)（QMP）分析鑒定到的微生物總豐度降低才是引起克羅恩病患者腸道微生物結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的根本原因。作者認(rèn)為目前大多數(shù)對于腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)的研究并不能體現(xiàn)出具體微生物數(shù)量改變對宿主帶來的影響，這些相對比例研究忽略了總體微生物豐度本身的改變可能是引起宿主產(chǎn)生疾病的主要原因這一可能性。所以，為了真正體現(xiàn)宿主-微生物群的相互作用，微生物群的研究必須將比例變成絕對量。

 

圖4. 克羅恩病的微生物數(shù)量變化

 

文章二  微生物類群豐度的絕對定量

 

英文題目: Absolute quantification of microbial taxon abundances

中文題目：微生物類群豐度的絕對定量

期刊名：The ISME Journal

發(fā)表時間：2017年

支持證據(jù)：

• 本研究對核試驗反應(yīng)堆上運(yùn)行的冷卻水回路系統(tǒng)進(jìn)行兩次40天調(diào)查（survey1和survey2），包括冷卻水系統(tǒng)沒有運(yùn)行的時間段（control），冷卻水系統(tǒng)啟動階段（start-up），冷卻水系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)運(yùn)行階段（operation）。
• 仔細(xì)檢查了兩個微生物分支betI-A分支和bacI-A分支的釋相對豐度和絕對豐度的時間軌跡時間軌跡（圖2）。結(jié)果檢測到兩個主要差異：1）：在群落成長期間，比如survey 1的start-up和早期 operation階段，絕對豐度有一個明確的過渡，顯示出bacI-A分支的生長和衰變；相反，在生長和衰變過程中，bacI-A分支的相對豐度則始終保持相對恒定，沒有任何過渡。2）：在survey2的operation后半部分，相對豐度曲線顯示從±40%增加到90%以上，暗示了betI-A分支的生長；相反，如果看絕對豐度，那么這個分支就沒有明顯的活躍生長，其細(xì)胞密度從未顯著超過start-up階段結(jié)束時觀察到的最大密度。◆
• 本文認(rèn)為微生物某一類群的富集（相對豐度比例的增加）不一定真正與相應(yīng)微生物類群生長（絕對豐度的增加）有關(guān)，可能是其它微生物類群的衰退導(dǎo)致了其在群落結(jié)構(gòu)中相對豐度比例的增長?！?

 

圖2 對在核試驗反應(yīng)堆上運(yùn)行的二級冷卻水回路進(jìn)行兩次時間分離的40天調(diào)查期間，2個最豐富的微生物淡水分支(bacI-A(OTU2，紅色；OTU3，橙色)和betI-A(OTU1，藍(lán)色))的時間動態(tài)圖。top panel顯示從擴(kuò)增子測序數(shù)據(jù)中推斷的相對豐度（in%），bottom panel顯示絕對OTU豐度（單位為細(xì)胞/μl）, 圓形標(biāo)簽表示微生物群落的總細(xì)胞密度（單位為細(xì)胞/μl±s.d）。最下方灰色區(qū)域表示冷卻水系統(tǒng)沒有運(yùn)行的時間段（控制階段），綠色區(qū)域表示啟動，藍(lán)色區(qū)域表示穩(wěn)態(tài)運(yùn)行。

 

文章三  土壤絕對定量方法結(jié)合相對豐度能夠反映微生物類群的真實變化

 

英文題目: Soil bacterial quantification approaches coupling with relative abundances reflecting the changes of taxa

中文題目：土壤絕對定量方法結(jié)合相對豐度能夠反映微生物類群的真實變化

期刊名：Scientific Reports

發(fā)表時間：2017年

支持證據(jù)：

•  本文采用16S rRNA高通量測序技術(shù)分析了北京和西藏草原土壤微生物群落中主要物種的相對豐度，并采用三磷酸腺苷（ATP）、流式細(xì)胞術(shù)(FCM)、定量實時PCR（qPCR）、磷脂脂肪酸（PLFA）和微生物量碳（MBC）等多個技術(shù)直接或間接地定量細(xì)菌的絕對細(xì)胞數(shù)。然后將兩者相結(jié)合計算估計絕對豐度(EAA) （EAA定義為某微生物類群的相對豐度乘以總的絕對微生物細(xì)胞數(shù)）。
• 通過對土壤微生物群落中主要組分的相對豐度和絕對豐度(EAA)的比較，發(fā)現(xiàn)一些優(yōu)勢菌門的相對豐度和絕對豐度(EAA) 表現(xiàn)出明顯不同的變化趨勢：例如北京地區(qū)樣本中Actinobacteria, Bacteroidetes, Chloroflexi 和 Gemmatimonates的相對豐度與西藏樣品無顯著差異，但北京地區(qū)樣本這些物種的估計絕對豐度EAA則顯著高于西藏樣品（圖2）。此外，北京地區(qū)Verrucomicrobia和Planctomycetes的相對豐度顯著高于西藏，但是其估計絕對豐度EAA則無明顯差異（圖2）。

 

圖2 北京和西藏草原主要門類相對豐度和絕對豐度(EAA)差異的響應(yīng)比。在95%的置信水平下，使用響應(yīng)比分析確定顯著性。響應(yīng)變量的95%CI不與0重疊表示顯著結(jié)果，否則不顯著。響應(yīng)比大于零表示北京樣品的豐度大于西藏樣品，反之亦然。

• 根據(jù)結(jié)果，本文提出了將相對豐度與定量結(jié)果相結(jié)合得到一個估算絕對豐度EAA的概念模型（圖6）。如圖6所示，給定的群落1和群落2中均有5個物種（每個物種一種顏色)，群落1有N個個體，群落2有M個個體，其中N大約是M的一半，計算每種物種的相對豐度，同時將定量檢測與相對豐度相結(jié)合可得到估算絕對豐度EAA。當(dāng)僅基于相對豐度時，群落1中紅色物種的相對豐度高于群落2，但基于估算絕對豐度EAA時，群落1中紅色物種的估算絕對豐度EAA則低于群落2。因此本文認(rèn)為，與宏觀生態(tài)學(xué)一樣，相對豐度的差異也不適合解釋自然條件下微生物群落的真實豐度差異。

 

圖6 估計絕對豐度(EAA)與相對豐度和定量檢測之間關(guān)系的概念模型

 

各位看官讀完上述文章如果有想做微生物絕對定量的想法，那就請聯(lián)系天昊生物吧，天昊生物是國內(nèi)唯一一家提供 “微生物16S擴(kuò)增子絕對定量測序”技術(shù)的服務(wù)商，。該方法通過向樣品DNA中添加一定量外標(biāo)序列，進(jìn)行16S擴(kuò)增子文庫構(gòu)建、測序，再根據(jù)外標(biāo)序列的16S擴(kuò)增子reads數(shù)及其絕對拷貝數(shù)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出樣品中OTU代表序列對應(yīng)物種16S rRNA基因絕對拷貝數(shù)。該方法是一種將qPCR絕對定量技術(shù)和常規(guī)16S擴(kuò)增子測序技術(shù)合二為一的技術(shù)，該技術(shù)不但可以進(jìn)行Alpha多樣性分析、群落組成分析、Beta多樣性分析和環(huán)境因子分析等常規(guī)擴(kuò)增子測序分析，而且可以解析樣本中總細(xì)菌和特定菌種的絕對拷貝數(shù)， 最大限度地便利了廣大微生態(tài)研究者。熱烈歡迎各位老師與我們交流溝通微生物絕對定量相關(guān)方面的問題~