PNAS：比較轉(zhuǎn)錄組推斷基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)及其在玉米和水稻葉片轉(zhuǎn)錄組中的應(yīng)用

發(fā)稿時(shí)間：2019-03-01來(lái)源：天昊生物

在不同條件下獲得的生物過(guò)程的時(shí)間序列轉(zhuǎn)錄組對(duì)于鑒別過(guò)程的調(diào)控因子及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)非常有用。然而，這樣的數(shù)據(jù)是三維（3D）的(基因表達(dá)、時(shí)間和條件)，目前沒(méi)有任何方法可以處理它們的全部復(fù)雜性。這里，研究者開(kāi)發(fā)了一種不同條件下無(wú)需時(shí)間點(diǎn)一致及均一化的方法。研究者應(yīng)用它分析了在明暗循環(huán)和完全黑暗條件下玉米葉片發(fā)育的時(shí)間序列轉(zhuǎn)錄組，獲得了八個(gè)時(shí)間序列基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(time-ordered gene coexpression networks，TO-GCNs)，這可以用來(lái)預(yù)測(cè)GCNs中任何基因的上游調(diào)節(jié)因子。八個(gè)TO-GCNs中的一個(gè)是不依賴光的，并且可能包括所有參與Kranz解剖學(xué)發(fā)育的基因，Kranz解剖學(xué)是C4植物高效光合作用的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)。使用這個(gè)TO-GCN，本文預(yù)測(cè)并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了一個(gè)位于SHORTROOT1上游的Kranz解剖學(xué)關(guān)鍵調(diào)節(jié)子。此外，應(yīng)用該方法還比較了玉米和水稻葉片轉(zhuǎn)錄本，并鑒定了玉米C4酶基因和RUBISCO SMALL SUBUNIT2的調(diào)節(jié)因子。本研究不僅提供了一種強(qiáng)有力的研究方法，也對(duì)Kranz解剖學(xué)發(fā)育和C4光合作用的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)提供了新的見(jiàn)解。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

LD或TD下玉米葉片的早期發(fā)育

為了說(shuō)明時(shí)間序列轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)新方法的必要性，研究者選擇研究玉米幼苗在自然光照-黑暗周期(light–dark cycle, LD, 13h光照/11h黑暗)及完全黑暗(total darkness, TD)。LD下，幼苗經(jīng)歷光形態(tài)建成。相比之下，在TD下，幼苗則會(huì)發(fā)生暗形態(tài)建成。眾所周知，在LD和TD下生長(zhǎng)的玉米幼苗都發(fā)育具有Kranz特征，因此LD和TD數(shù)據(jù)的比較有助于去除大量不參與Kranz解剖學(xué)發(fā)育的光調(diào)節(jié)基因。

實(shí)驗(yàn)所用玉米葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

在這項(xiàng)研究中，研究者在TD下獲得了一組12個(gè)發(fā)育胚胎葉片的時(shí)間進(jìn)程轉(zhuǎn)錄組（從干種子開(kāi)始每6h取樣測(cè)定，從0h到吸脹后72h）。通過(guò)結(jié)合前人2013年在LD相同時(shí)間點(diǎn)取樣測(cè)定結(jié)果，并且在T00 (干種子) 共享轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，最終在LD和TD下?lián)碛袃山M13個(gè)轉(zhuǎn)錄組。序列reads經(jīng)過(guò)處理和比對(duì)，以及RPKMs的標(biāo)準(zhǔn)化。如果在25個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中至少有2個(gè)轉(zhuǎn)錄組的RPKM>1，就被認(rèn)為是一個(gè)表達(dá)的基因?？偣灿?/span>25489個(gè)基因，包括1718個(gè)TF (轉(zhuǎn)錄因子)基因被認(rèn)定是表達(dá)的，并用于后續(xù)分析。

3D轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析的方法學(xué)探討

當(dāng)比較從兩個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目中獲得的兩組轉(zhuǎn)錄組時(shí)，考慮時(shí)移效應(yīng)是很重要的。然而，這并不簡(jiǎn)單，因?yàn)榛蛑g的時(shí)移程度不同。為了克服這一點(diǎn)，本研究首先考慮在每組時(shí)間序列轉(zhuǎn)錄組基因的共表達(dá)，然后比較LD和TD下的共表達(dá)模式(圖1A )。具體來(lái)說(shuō)，研究者考慮兩個(gè)在LD下共表達(dá)的基因是否也在TD下共表達(dá)，反之亦然。然后利用基因共表達(dá)關(guān)系構(gòu)建GCNs。此外，由于扮演就利用的數(shù)據(jù)是時(shí)間進(jìn)程數(shù)據(jù)，因此方法還可以確定GCN中節(jié)點(diǎn)的時(shí)間順序(圖1B )。時(shí)序GCN可以揭示基因功能的動(dòng)態(tài)和生物過(guò)程的時(shí)間轉(zhuǎn)變(圖1B )。下面，具體解釋如何計(jì)算基因共表達(dá)關(guān)系，然后構(gòu)建TO-GCNs。

基因共表達(dá)關(guān)系和網(wǎng)絡(luò)計(jì)算

為了簡(jiǎn)單起見(jiàn)，研究者首先關(guān)注TF基因。本研究定義了兩個(gè)TF基因之間的共表達(dá)關(guān)系，或者TF基因和非TF基因之間的共表達(dá)關(guān)系，如下所示。首先，分別計(jì)算LD和TD下1718個(gè)表達(dá)的TF基因的所有對(duì)的原始RPKM值的Pearson相關(guān)系數(shù)(PCC)，發(fā)現(xiàn)任何兩個(gè)TF基因之間的PCC超過(guò)0.84的概率為P<0.05。對(duì)于TF和非TF基因之間的共表達(dá)，閾值是相似的。因此，如果PCC≥0.84，將兩個(gè)基因定義為正共表達(dá)(根據(jù)數(shù)據(jù)集表示為LD+或TD+)。此外，如果-0.5≤PCC<0.5，即將兩個(gè)基因定義為非共表達(dá)(表示LD0或TD0)，如果PCC<-0.5，研究者將兩個(gè)基因定義為負(fù)共表達(dá)(表示LD-或TD-)。綜合考慮LD和TD下的共表達(dá)狀態(tài)，認(rèn)為如果兩個(gè)基因在LD和TD下都是正共表達(dá)的，那么它們屬于LD+TD+關(guān)系的集合。類似地，如果它們只在LD (或TD )下正共表達(dá)，兩個(gè)基因?qū)儆?/span>LD+TD0 (或LD0TD+ )，而在TD (或LD )下不正共表達(dá)。研究者對(duì)非表達(dá)基因( LD0TD0 )不感興趣。只檢測(cè)了LD+TD+，這可能包括Kranz解剖發(fā)育中的所有關(guān)鍵基因。

在LD+TD+集合中，共表達(dá)關(guān)系依賴于光效應(yīng)，這使得研究者能夠縮小Kranz解剖結(jié)構(gòu)的細(xì)胞調(diào)節(jié)因子。LD+TD+中的1275個(gè)TF基因中，1207個(gè)形成了一個(gè)大的、主要的TF GCN，TF基因的節(jié)點(diǎn)通過(guò)共表達(dá)關(guān)系連接起來(lái)。這個(gè)GCN被稱為光不依賴的TF GCN。剩余的68個(gè)TF基因形成28個(gè)GCNs，每個(gè)GCNs具有<10個(gè)TF基因。由于GCN中連接的TF基因在時(shí)間進(jìn)程中具有相似的上調(diào)或下調(diào)時(shí)間點(diǎn)，研究者可以推斷主要GCN中所有TF基因在葉片發(fā)育期間的表達(dá)時(shí)間順序。為此，研究者選擇ZmARF2-1 (AUXIN RESPONSE FACTOR2-1；Zm00001d041056)作為初始節(jié)點(diǎn)，因?yàn)樗?/span>LD下T00處具有峰值表達(dá)的第一個(gè)共表達(dá)模塊，也就是說(shuō)，它在時(shí)間0處的表達(dá)水平非常高(RPKM 96)，并且單調(diào)下降，直到T72。此外，ZmARF2-1是生長(zhǎng)素反應(yīng)因子，生長(zhǎng)素是細(xì)胞分裂和幼苗發(fā)育中重要的植物激素。這些觀察結(jié)果與假設(shè)相符，即ZmARF2-1在萌發(fā)過(guò)程中起作用。然后，應(yīng)用廣度優(yōu)先搜索(BFS)算法為所有TF基因分配時(shí)間順序級(jí)別中的主要GCN。將這個(gè)主要的GCN稱為與光無(wú)關(guān)的TF TO-GCN，它由15個(gè)時(shí)間順序級(jí)別組成(在圖2A中表示為L₁至L₁₅)。

圖1、比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法流程圖。(A)構(gòu)建轉(zhuǎn)錄因子（TF）時(shí)序基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的三個(gè)步驟。以獨(dú)立于光(LD+TD+)、暗特異性(LD0TD+)和光特異性( LD+TD0) GCNs為例顯示。+/-，正/負(fù)共表達(dá)。(B) 在TO-GCN中代表時(shí)間順序中TF基因上調(diào)的水平(L₁至L_M)，對(duì)應(yīng)于不同水平的共表達(dá)基因集(S₁至S_M) (包括非TF基因)以及過(guò)度表達(dá)功能。L₁中的黃色節(jié)點(diǎn)代表初始節(jié)點(diǎn)。一個(gè)集合中的基因可能在多個(gè)水平上與TF共同表達(dá)，因此它們可能屬于多個(gè)集合。

獨(dú)立于光的TF TO-GCN分析

如上所述，獨(dú)立于光的TF TO-GCN中的TF基因被分配到15個(gè)水平(圖2A)。這些指定的水平與LD和TD下13個(gè)時(shí)間點(diǎn)上TF基因的表達(dá)時(shí)間順序相匹配，如平均標(biāo)準(zhǔn)化RPKMs (z scores)的兩個(gè)熱圖中沿對(duì)角線的紅色正方形(高表達(dá)水平)所示(圖2B和C)。此外，高表達(dá)時(shí)間周期在連續(xù)水平之間重疊，表明某一水平的TF基因可能是下一水平TF基因的調(diào)控者。此外，相同水平的大多數(shù)TF基因在TD下比LD下更早被上調(diào)或下調(diào)(圖2B和C )。例如，L₁的TF基因在LD下的T₁₂下調(diào)，而在TD下的T06下調(diào)(圖2B和C )。

獨(dú)立于光的功能分析

通過(guò)在與光無(wú)關(guān)的TO-GCN (圖2A和數(shù)據(jù)集S2)的每個(gè)水平上識(shí)別共表達(dá)基因中過(guò)度表達(dá)的功能類別，研究者發(fā)現(xiàn)L₈和L₉之間有明顯的發(fā)育階段轉(zhuǎn)變(圖2D )。在最初的八個(gè)水平上，泛素化介導(dǎo)的蛋白質(zhì)降解比例過(guò)高。在前四個(gè)水平上，其他九個(gè)功能也過(guò)度表達(dá)，包括，例如，蛋白質(zhì)翻譯后修飾、脫落酸的激素代謝(ABA)、生物和非生物脅迫、線粒體膜上的代謝物轉(zhuǎn)運(yùn)體和鉀的轉(zhuǎn)運(yùn)(圖2D)。

植物激素是引發(fā)發(fā)育重編程的關(guān)鍵。研究者發(fā)現(xiàn)與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因往往在前三個(gè)水平出現(xiàn)，但隨后會(huì)減少，這與ABA維持種子休眠直至萌發(fā)開(kāi)始一致(圖2E )。與ABA相反，大多數(shù)與赤霉素(GA)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因出現(xiàn)在L₂和L₃，這與GA對(duì)ABA誘導(dǎo)萌發(fā)過(guò)程的拮抗作用一致。大多數(shù)與生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素(CK)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)的基因分別出現(xiàn)在L₉至L₁₅和L₁₀至L₁₃ (圖2E)。這也與以前的研究一致，即這兩種激素一起在調(diào)節(jié)葉細(xì)胞增殖和分化中起主要作用。

圖2、與光無(wú)關(guān)的TF TO-GCN和不同水平TF基因的標(biāo)準(zhǔn)化基因表達(dá)譜。(A)以TF基因?yàn)楣?jié)點(diǎn)的TO-GCN結(jié)構(gòu)(藍(lán)色虛線圓圈)。圓圈中的數(shù)字表示該水平的TF基因數(shù)。(B和C)分別是LD和TD下TO-GCN每個(gè)水平上TF基因每個(gè)時(shí)間點(diǎn)的平均標(biāo)準(zhǔn)化RPKMs (z scores)的熱圖。對(duì)于每個(gè)TF基因，時(shí)間點(diǎn)上的RPKMs首先被標(biāo)準(zhǔn)化為z scores。對(duì)于每個(gè)級(jí)別，所有TF的z scores在熱圖中為平均值。(D)每個(gè)水平上共表達(dá)基因的過(guò)度表達(dá)MapMan功能及列表。圖中的數(shù)字(頂部)對(duì)應(yīng)于表(底部)中列出的過(guò)度表示功能的索引號(hào)。藍(lán)色、橙色和綠色分別代表發(fā)芽、葉子發(fā)育和光合作用階段。(E)在每個(gè)TO-GCN水平上，四種激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的基因比例。

關(guān)鍵Kranz解剖調(diào)節(jié)子的上游調(diào)節(jié)因子

ZmSHR1在玉米Kranz解剖結(jié)構(gòu)的BS細(xì)胞發(fā)育中發(fā)揮了重要作用，但其上游調(diào)節(jié)因子仍未知。因此，本研究選擇ZmSHR1作為例子，來(lái)展示該方法如何被用來(lái)識(shí)別特定基因的上游調(diào)節(jié)因子。具體來(lái)說(shuō)，使用獨(dú)立于光的TF TO-GCN設(shè)計(jì)了一個(gè)三步工作流程(圖3)來(lái)識(shí)別調(diào)節(jié)ZmSHR1表達(dá)的上游調(diào)控途徑。

首先，使用TO-GCN來(lái)預(yù)測(cè)ZmSHR1的候選直接調(diào)節(jié)子，該調(diào)節(jié)子應(yīng)該與ZmSHR1在與ZmSHR1相同的水平上或在ZmSHR1之前的一個(gè)水平上共表達(dá)(即，圖3A中的L₁₁和L₁₀)。(一個(gè)TF可以是同一水平上另一個(gè)TF的上游調(diào)節(jié)因子，稱這些TF為一級(jí)候選調(diào)節(jié)子。類似地，研究者分別推斷L₉、L₈和L₇處的二階、三階和四階候選調(diào)節(jié)子(圖3A )。其次，對(duì)于每個(gè)具有未知TFBS (轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn))的候選調(diào)節(jié)子，采用前人方法和擬南芥TFs的TFBS數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)其TFBS， (由圖3A中的紅色表示預(yù)測(cè)的TFBSs)。對(duì)于那些在圖3A中用橙色表示的TFs，我們無(wú)法預(yù)測(cè)它們的TFBSs，因?yàn)橛衩缀蛿M南芥之間的DNA結(jié)合域太大，或者沒(méi)有擬南芥數(shù)據(jù)。第三，對(duì)于具有已知或預(yù)測(cè)TFBS的每個(gè)TF，檢查了每個(gè)可誘導(dǎo)靶基因啟動(dòng)子區(qū)域中TFBS的存在。該過(guò)程進(jìn)一步將圖3A中的網(wǎng)絡(luò)簡(jiǎn)化為圖3B中的網(wǎng)絡(luò)。

接下來(lái)，我們使用電泳遷移率轉(zhuǎn)移分析(EMSA)和原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化分析(PTA)來(lái)驗(yàn)證對(duì)候選調(diào)節(jié)因子及其假設(shè)目標(biāo)基因的預(yù)測(cè)。EMSA和PTA實(shí)驗(yàn)都支持由圖3B中的紅色箭頭表示的上游調(diào)節(jié)級(jí)聯(lián)關(guān)系；也就是說(shuō)，ZmARF1-2是ZmWRKY39的直接上游調(diào)節(jié)子，而ZmWRKY39又是ZmMYB117的直接上游調(diào)節(jié)子，然后ZmWRKY39充當(dāng)ZmWRKY39的直接上游調(diào)節(jié)子。

圖3、玉米葉片發(fā)育中ZmSHR1基因候選上游調(diào)節(jié)因子的推斷和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。(A)從獨(dú)立于光的TF TO-GCN推斷出的ZmSHR1的一階至四階候選上游調(diào)節(jié)因子。ZmSHR1位于第11層子網(wǎng)的中心。沒(méi)有已知轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（transcription factor binding site，TFBS）的TFs以橙色顯示。已知的TFs TFBSs (藍(lán)色)用于檢測(cè)它們的候選下游基因啟動(dòng)子序列中是否存在它們的定位位點(diǎn)。TFBS支持的預(yù)測(cè)調(diào)節(jié)途徑中的TFs以紅色顯示，并用于實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。(B)針對(duì)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證的ZmSHR1上游調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。實(shí)線方向或帶箭頭的虛線旁邊的數(shù)字代表原生質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)（protoplast transient assay，PTA）實(shí)驗(yàn)中潛在直接或間接靶基因表達(dá)水平的倍數(shù)增加。紅線：目標(biāo)基因啟動(dòng)子中TFBS的存在(如箭頭所示)，并經(jīng)PTA和EMSA驗(yàn)證?；疑摼€：支持PTA，但在啟動(dòng)子中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)TFBS。(C-F) EMSA實(shí)驗(yàn)，測(cè)試推定靶啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)的TFBSs與GST-ZmmTERF1 (C)、GST-ZmARF1-2 (D)、GST-ZmWRKY39 (E)或GST-ZmMYB117 (F)之間的相互作用。在每種情況下：泳道1：?jiǎn)为?dú)生物素標(biāo)記的探針；泳道2至4：隨著純化GST量的增加(C除外)；泳道5至7：隨著GST-TF量的增加；和泳道8至10：隨著未標(biāo)記探針數(shù)量的增加(C除外)。

鑒定C4酶基因的調(diào)節(jié)子

為了展示我們方法的廣泛應(yīng)用，研究者分析了Wang等人的3D數(shù)據(jù)。這是分別來(lái)自玉米(C4)和水稻(C3)第三發(fā)育葉片的15和11段的兩組轉(zhuǎn)錄組。請(qǐng)注意，這里我們考慮的是空間點(diǎn)，而不是時(shí)間點(diǎn)。按照本研究方法，研究者成功找到并鑒定了那些關(guān)鍵C4酶基因共表達(dá)的TF基因，并且候選TF通過(guò)EMSA實(shí)驗(yàn)得以驗(yàn)證。

結(jié)論：

這項(xiàng)研究的主要貢獻(xiàn)是比較不同條件(或組織/器官或物種)和時(shí)間點(diǎn)(或空間點(diǎn))下獲得的3D轉(zhuǎn)錄組的方法，展示了一種分析3D數(shù)據(jù)集的有效方法的實(shí)用性。它可以在廣泛的背景下應(yīng)用于對(duì)比基因共表達(dá)譜。