Atmospheric Environment：對(duì)真菌氣溶膠種群進(jìn)行相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度比較研究

發(fā)稿時(shí)間：2019-02-27來(lái)源：天昊生物

 

英文題目: Combining real-time PCR and next-generation DNA sequencing to

provide quantitative comparisons of fungal aerosol populations

中文題目：結(jié)合qPCR和二代測(cè)序?qū)φ婢鷼馊苣z種群進(jìn)行定量比較

期刊名：Atmospheric Environment

影響因子： 3.708

 

研究摘要

我們調(diào)查了春季和秋季收集到的以色列新罕布什爾州室外空氣樣本的真菌群落。利用二代測(cè)序（ITS）對(duì)真菌群落進(jìn)行了解析。為了更定量地比較人體中的真菌暴露，將特定真菌分類群的相對(duì)豐度值（二代測(cè)序）乘以樣本的真菌孢子總量（來(lái)源于通用真菌的qpcr），從而轉(zhuǎn)化為絕對(duì)豐度。接下來(lái)，將Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Epicoccum nigrum, Penicillium/ Aspergillus spp.由此得到的絕對(duì)豐度與這四個(gè)分類群特異引物定量PCR得到的絕對(duì)豐度進(jìn)行比較。這些比較結(jié)果表明：1）由相對(duì)豐度值（二代測(cè)序）乘以樣本真菌孢子總量（通用真菌qpcr）產(chǎn)生的絕對(duì)豐度與來(lái)自物種特異性引物定量PCR得到的絕對(duì)豐度密切相關(guān)（對(duì)于所有四個(gè)物種，p<0.005，所有R>0.70）, 對(duì)于濃度較高的物種，相關(guān)系數(shù)較大；2）我們的微生物氣溶膠種群分析表明，春季的真菌多樣性（OTU數(shù)量）高于秋季（p=0.02），主坐標(biāo)分析顯示，類群分布存在明顯的季節(jié)性差異（ANOSIM p=0.004）；3）在致敏和/或致病菌屬中，Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Cladosporium的絕對(duì)豐度在秋季更高，而Cryptococcus, Penicillium, and Ulocladium絕對(duì)豐度在春季更高。將二代測(cè)序得到的真菌相對(duì)豐度數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為絕對(duì)豐度，可以改善基于二代測(cè)序的定量氣溶膠暴露評(píng)估。

研究背景

二代測(cè)序技術(shù)引入到環(huán)境科學(xué)中從而加強(qiáng)了對(duì)室內(nèi)空氣和大氣樣本中微生物種群的探索。最近的研究為大氣中真菌種群的多樣性提供了新的信息，使人們對(duì)室內(nèi)真菌氣溶膠（由固體或液體小質(zhì)點(diǎn)分散并懸浮在氣體介質(zhì)中形成的膠體分散體系）的來(lái)源有了更深入的了解，使用這些遺傳方法有望將真菌氣溶膠種群和人類健康影響聯(lián)系起來(lái)?；?/span>DNA序列的方法避免了與培養(yǎng)相關(guān)的顯著多樣性偏差，因此可以檢測(cè)可能對(duì)健康或環(huán)境造成影響的不可培養(yǎng)真菌或真菌孢子。此外，二代測(cè)序因其高通量，因此可以深入提供關(guān)于真菌種群的多樣性信息。真菌DNA的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）被認(rèn)為是鑒定真菌的主要條形碼標(biāo)記，由于其高變異性以及二代測(cè)序長(zhǎng)度可以囊括ITS1和ITS2兩個(gè)區(qū)域，因此可以用于識(shí)別不同分類水平的物種。

大氣氣溶膠樣品中真菌ITS序列分析的中心輸出數(shù)據(jù)是一個(gè)分類群列表，其報(bào)告了樣本中不同的種、屬或其他分類群占所產(chǎn)生總序列數(shù)的百分比，即相對(duì)豐度。然而，對(duì)于不同的樣品，大氣樣品中的總真菌豐度通常是不同的，因此，特定物種的相對(duì)豐度值并不能對(duì)不同氣溶膠樣品之間進(jìn)行有意義的定量比較，例如，兩個(gè)樣品，每個(gè)樣品由25%的枝孢霉屬組成，但在真菌孢子總數(shù)則有10倍的差異，那該屬的絕對(duì)量上也有10倍的差異。因此為了定量地解釋總真菌種群的這些變化，必須通過(guò)將相對(duì)豐度乘以樣本真菌孢子總量，從而將相對(duì)豐度值轉(zhuǎn)化為絕對(duì)豐度。

本研究的目的是確定將總真菌量與特定類群相對(duì)豐度相乘得到的絕對(duì)值是否能準(zhǔn)確反映這些特定類群的絕對(duì)豐度。我們利用在以色列Rehovot上空采集的季節(jié)性PM10樣品經(jīng)過(guò)羅氏454測(cè)序得到的真菌ITS序列來(lái)鑒定不同的大氣真菌種群。然后，將四個(gè)選定真菌類群（Alternaria alternata, Cladosporium cladosporioides, Epicoccum nigrum, Penicillium/Aspergillus spp.）的相對(duì)豐度乘以由通用真菌引物定量PCR生成的總真菌量，并將由此得到的絕對(duì)豐度與這四個(gè)分類群特異引物定量PCR得到的絕對(duì)豐度進(jìn)行比較，將相對(duì)豐度轉(zhuǎn)換為絕對(duì)豐度可顯著提高空氣中真菌的準(zhǔn)確測(cè)量能力。

研究對(duì)象

空氣樣本是在石英纖維過(guò)濾器上采集的，該過(guò)濾器放置在高容量PM₁₀采樣器中，該采樣器位于以色列Rehovot一座四層建筑頂部。由于以色列位于歐洲、亞洲和非洲交匯處，受沙塵暴、交通和風(fēng)的影響，真菌氣溶膠和過(guò)敏原的數(shù)量預(yù)計(jì)將隨季節(jié)變化。采樣后，過(guò)濾器存儲(chǔ)在-20度直到進(jìn)一步分析。共有13個(gè)樣本被收集，其中包括3個(gè)生物重復(fù)（Biological replicates）。通過(guò)對(duì)從過(guò)濾器中提取的相同核酸進(jìn)行種群分析，也產(chǎn)生了3個(gè)技術(shù)重復(fù)（Technical replicates）。春季樣品包括4月和5月的六個(gè)單獨(dú)采樣日期，秋季樣品包括9月的三個(gè)不同采樣日期，1月采集了一個(gè)冬季樣品。此后，1月份采集的樣品稱為“冬季”樣品，4、5月份采集的樣品稱為“春季”樣品，9月份采集的樣品稱為“秋季”樣品。采樣數(shù)據(jù)和氣象信息是見(jiàn)表1。

 

表1樣本匯總、天氣條件和多樣性值

研究結(jié)果

共有22854個(gè)序列通過(guò)了質(zhì)控，每個(gè)樣本的平均序列數(shù)為1428個(gè)（范圍692-2370）。所有樣本共鑒定出2488個(gè)OTU。樣本A的多樣性指標(biāo)是通過(guò)樣本中隨機(jī)選取的650條序列chao1和香農(nóng)多樣性指數(shù)（表1）來(lái)估計(jì)的，稀疏曲線如圖1a所示。根據(jù)樣本，chao1預(yù)測(cè)了268-1210個(gè)OTU，這與之前在美國(guó)加利福尼亞州北部和美國(guó)東北部的室外空氣中描述的豐富程度相似。比較重復(fù)樣本，技術(shù)重復(fù)的OTU豐富度的累積變異系數(shù)為5.9%，生物復(fù)制的累積變異系數(shù)為12%。同時(shí)測(cè)定了真菌種類絕對(duì)濃度的重現(xiàn)性。在物種等級(jí)上，技術(shù)重復(fù)(R =0.991)比生物重復(fù)(R =0.966)具有更高的重復(fù)性（圖1C和D）。

 

圖1技術(shù)重復(fù)和生物重復(fù)物種相對(duì)豐度的稀釋性曲線和重復(fù)性比較

二代測(cè)序和特異性引物qPCR分別得到的物種絕對(duì)豐度比較

通過(guò)qpcr分析，測(cè)定了前一項(xiàng)研究中所有真菌, A. alternata, A. fumigatus, C. cladosporioides, E. nigrum, Penicillium group 3, Penicillium/Aspergillus的絕對(duì)豐度，前一項(xiàng)研究集中關(guān)注這些相同氣溶膠樣品的麥角固醇含量。二代測(cè)序的絕對(duì)豐度值=每個(gè)樣本特定分類群的相對(duì)豐度乘以真菌孢子總量（用通用真菌引物的qpcr測(cè)量）（A _taxon=R _taxon*F _qPCR）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些來(lái)自二代測(cè)序的絕對(duì)豐度與來(lái)自物種特定引物qpcr的絕對(duì)豐度相關(guān)（圖2）。當(dāng)所有四個(gè)分類群被一起考慮時(shí)（p<0.0001，R=0.86, 圖2），或當(dāng)單獨(dú)考慮特定分類群時(shí)（所有p<0.005，所有R>0.70，圖3），這些相關(guān)性都很強(qiáng)。對(duì)于豐度較高的物種，相關(guān)系數(shù)較高（圖2b）。

 

圖2 來(lái)自二代測(cè)序的絕對(duì)豐度與來(lái)自物種特定引物qpcr的絕對(duì)豐度相關(guān)性分析

 

圖3 四個(gè)真菌分類群來(lái)自二代測(cè)序的絕對(duì)豐度與來(lái)自物種特定引物qpcr的絕對(duì)豐度相關(guān)性分析

真菌群落的季節(jié)性差異

在所有的季節(jié)中，Cladosporium是最豐富的屬，dothidomycetes是最豐富的綱，而Ascomycota是最豐富的門，真菌群落的總體多樣性和分類組成隨季節(jié)而變化，春季真菌豐富度（OTU數(shù)）高于秋季（P<0.02）（圖1a和b）。使用Morisita Horn非系統(tǒng)發(fā)育距離對(duì)微生物種群進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果顯示真菌群落按季節(jié)的分離具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（圖4）。

 

 

圖4使用Morisita Horn非系統(tǒng)發(fā)育距離對(duì)微生物種群進(jìn)行主坐標(biāo)分析

相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度的差異反映在門水平（圖5a和b）。相對(duì)豐度分析表明，在春季Basidiomycota的數(shù)量相對(duì)秋季較豐富（P<0.03），而在秋季，Ascomycota的數(shù)量相對(duì)春季較豐富（P<0.03），使用絕對(duì)豐度數(shù)據(jù)時(shí)，這些差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

 

圖5 通過(guò)（a）相對(duì)豐度和（b）絕對(duì)濃度分析氣溶膠樣品中真菌門分布

在種、屬和綱水平上也進(jìn)行了季節(jié)比較。經(jīng)過(guò)多次比較調(diào)整后，許多種、屬和綱的相對(duì)豐度在某一特定季節(jié)明顯更豐富（表2）。

 

表2秋季或春季相對(duì)豐度較高的真菌類群

通過(guò)測(cè)序確定了八種已知的致敏/或致病菌，包括A. alternata, Aspergillus ustus, Aspergillus versicolor, C. cladosporioides, E. nigrum, Penicillium bre-vicompactum, Pleospora herbarum, Stachybotrys chartarum（表3）。比較了這些物種在春季和秋季的相對(duì)豐度和絕對(duì)豐度，在這八種致敏性/致病性物種中，使用相對(duì)豐度，只有C. cladosporioides在秋季明顯豐度，在春季則沒(méi)有一種物種更豐富；使用絕對(duì)豐度，沒(méi)有物種有顯著差異。

 

 

表3基于相對(duì)豐度或絕對(duì)豐度，春季或秋季更豐富的致敏/致病物種和屬

潛在的致敏性和/或致病性分類群也在屬水平進(jìn)行了檢測(cè)，其中一些屬無(wú)論使用相對(duì)豐度或絕對(duì)豐度在春季或秋季都更豐富（表3，圖6a和b）：使用相對(duì)豐度，Aspergillus, Cladosporium, Fusarium春季較為豐富，而Cryptococcus, Penicillium, Ulocladium在秋季較為豐富。使用絕對(duì)濃度，秋季只有Alternaria更為豐富，春季則無(wú)致敏性和/或致病性屬更為豐富。因此，基于相對(duì)豐度和絕對(duì)濃度的數(shù)據(jù)解釋支持關(guān)于季節(jié)性真菌差異的不同結(jié)論。由于春季兩個(gè)采樣日期（E/F和I/J）中的大氣總真菌量較低，而秋季L樣本中的大氣總真菌量較高，因此在使用基于相對(duì)豐度的方法進(jìn)行定量比較時(shí)，在這些日期暴露于所有過(guò)敏原就會(huì)被誤解。

 

圖6 致敏性和/或致病性種屬的熱圖。a使用相對(duì)豐度數(shù)據(jù)，b使用絕對(duì)豐度數(shù)據(jù)

 

天昊生物擁有極為豐富的微生物測(cè)序項(xiàng)目經(jīng)驗(yàn)，目前已助力客戶成功發(fā)表科研文章數(shù)十篇，同時(shí)天昊生物是國(guó)內(nèi)唯一一家提供 “微生物16S擴(kuò)增子絕對(duì)定量測(cè)序”技術(shù)的服務(wù)商，熱烈歡迎各位老師與我們交流溝通微生物絕對(duì)定量相關(guān)方面的問(wèn)題~