Hepatology--單細胞轉錄組測序：僅1個組織樣本+2種細胞系

發(fā)稿時間：2019-02-25來源：天昊生物

 

文章題目

Single-Cell Analysis Reveals Cancer Stem Cell Heterogeneity in Hepatocellular Carcinoma, Hepatology, IF: 14.079, 2018年7月，DOI: 10.1002/hep.29778.

 

研究背景

肝細胞癌（HCC）的異質性對于其治療是個巨大的阻礙，然而在單細胞水平上揭示HCC瘤內異質性的報道還十分有限。腫瘤干細胞（CSCs）在腫瘤異質性中扮演重要角色，同時助長了治療抗性、腫瘤復發(fā)和轉移。因此急需從腫瘤細胞群落、細胞層次結構和特定癌種的細胞多樣性等角度去了解瘤內異質性。當前的研究策略多是基于bulk tissue（塊狀組織），這樣的方法不足以很好地揭示腫瘤進化和細胞群落。然而單細胞測序技術是解決這一問題的完美方案！

 

技術路線

 

 

主要內容

 

1. 肝CSCs表型和異質性驗證

基于已經明確的HCC CSCs細胞表面marker，首先利用免疫熒光染色和流式分析表征商業(yè)化的抗體鑒定不同CSC亞群的能力，包括CD13, CD24, CD44, CD90, CD133, 和EpCAM（圖1）。共聚焦成像顯示HuH1和HuH7細胞系無論在單分子層（圖1A）或球狀（圖1B）的狀態(tài)下，CSC亞群的異質性均比較顯著。

 

圖1 HCC細胞CSC表面marker異質性表達

然后利用流式基于單個marker分選CSC亞群，于96孔板培養(yǎng)評估其自我更新（self-renewal）的潛能。HuH1中大約15%-20% marker陽性的CSC（圖2A），HuH7中大約8%-12%可以分化（圖2B），而低氧條件下（促進干性）只有特定的CSC亞群能夠分化（圖2A, B）。然后對培養(yǎng)2周后的單個marker表達的細胞進行計數，發(fā)現(xiàn)在HuH1和HuH7細胞中不同CSC亞群其自我更新能力差異巨大（圖2C, D）。而與未分選的細胞相比，單個marker表達的細胞可以在不同程度上擴展形成混合的CSCs群（圖2E）。

 

圖2 marker明確的CSC功能分析

總體上這些結果能夠說明利用單個細胞表面marker能夠發(fā)現(xiàn)明顯的CSC亞群，它們具有高度的自我更新的能力。

 

2. 單個肝CSCs轉錄組圖譜及異質性

為了確定單個marker表達的CSC中生物學差異是否與不同的分子特征相關，首先利用單細胞SMART-seq技術對單細胞轉錄組進行表征，方法策略詳見技術路線，分別對單個細胞、10個或100個細胞的pool進行分析，同時結合單細胞轉錄組測序的公共數據比較，包括人胚胎干細胞（hSEC）、小鼠內皮細胞（mEC）、小鼠造血干細胞（mHSC）。主成分分析發(fā)現(xiàn)，每種細胞類型有明顯不同的轉錄組特征（圖3A）。無論是HCC細胞系還是新鮮分離的腫瘤樣本，每個細胞群下的單個細胞其轉錄組是不同的，但是這樣的不同在10個或100個細胞的pool中會消失，這表明轉錄組的異質性確實在單細胞水平上存在，而在pool樣本中顯著降低（圖3A）。單個HuH7細胞基于marker表達聚類結果如圖3B。

 

圖3A-B 單細胞轉錄組揭示marker明確的CSC異質性

如果單細胞中marker基因表達帶來的轉錄組差異在功能上是重要的，那這些改變應當與HCC生存相關。因此基于3個marker陽性（Triple⁺）和陰性（Triple^-）（CD133/CD24/EpCAM）進行分類比較，其中286個基因與Triple⁺相關。利用這286個基因特征進行預后分析，LCI cohort腫瘤樣本中log-rank和permutation分析Triple⁺能夠預測整體生存率，交叉驗證的結果更顯著（圖3C）；而在非腫瘤樣本中不存在這樣的關系（圖3D），這說明Triple⁺ marker特征是腫瘤特異性的。相似的結果在TCGA cohort中也有發(fā)現(xiàn)（圖3E）。

 

圖3C-E 基于特征基因進行生存風險預測

對HuH7細胞中基于單個marker分選的CSC亞群分析發(fā)現(xiàn)基因表達重疊較少（圖4A），網絡分析顯示與不同maker基因特征相關的top networks大部分也不能重疊（圖4C-F）。而這些marker特征能夠預測不同cohort的整體生存率（圖4B）。

 

圖4 marker明確的CSC顯著不同的分子信號及預后相關

 

3. 肝細胞群轉錄組圖譜及異質性

為了確定整體細胞群的多樣性，利用10x Genomics GemCode技術對HuH1, HuH7和P1中的細胞進行單細胞轉錄組測序，共3847個單細胞以tSNE可視化（圖5），與明確的marker狀態(tài)下單細胞測序數據一致，出現(xiàn)明顯不同的細胞類型（圖5A）。已知的CSC marker基因，已知的HCC特異的基因以及干性相關/免疫細胞基因的表達特征如圖5B-D，說明細胞間異質性存在。

 

圖5 10x Genomics單細胞轉錄組數據展示

 

結論

文章最后也討論了研究的局限性：僅僅依據兩種HCC細胞系和一個臨床樣本；數據的優(yōu)化問題。而文章揭示的HCC中CSC分子組成和異質性可能對于CSC靶向治療有重要作用，基于單細胞轉錄組數據評估CSC異質性及預后的價值能對瘤內異質性、腫瘤進展和臨床意義提供新的視角。

 

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